t t,',' * '. 1 '. -I 'v C, r ; , ill;': '■.•,'..! ■ ,■ ELECTRON MICROSCOPY Proceedings of the Stockholm Conference SEPTEMBER 1956 ELECTRON MICROSCOPY ELECTRON MICROSCOPY Proceedings of the Stockholm Conference September 1956 EDITORS F.S.Sjostrand and J. Rhodin ACADEMIC PRESS INC., PUBLISHERS, NEW YORK, N.Y. PRINTED IN SWEDEN Alinqvist & Wiksells BOKTRYCKERI AKTIEBOLAG UPPSALA 1957 To the Memory of BODO VON BORRIES CONTENTS Preface F. S. Sjostrand Zum Gedenken an Bodo v. Borries E. RUSKA Commemorative address in honour of Bodo v. Bor- ries V. E. COSSLETT I. INSTRUMENTATION Observation directe des surfaces metalliques par re- flexion (Invited paper). Ch. Pert Objekticiihlung im Elektronenmikroskop. O. SCHOTT UND S. LeISEGANG Richtstrahlwerte der kalten Kathode. L. Wegmann UND M. Gribi 1 II. ELECTRON OPTICS tJber asymptotische Bildfchlcr. ■X P. Lenz 48 Zur Errechnung elektronenoptischer Peldvertei- lungen mit geforderten Abbildungscigenschaftcn. 52 5 K.W. J. PicuT Lentilles cicctroniques magnetiques. Regies de leur construction et expressions uni\crscllcs de leurs caractcristiques electro-optiqucs. 55 P. DURANDEAU 8 III. ELECTRON-SPECIMEN INTERACTION A Scanning Microscope with either Electron or X- Ray Recording. J 2 V. E. CoSSLETT AND P. DUNCUMB Imaging Elements Operating with Permanent Mag- nets. 14 B. V. Borries, G. Langner and W. Scheffels LJber magnetostatische Linsenanordnungen mit me- chanischen Regelgliedern. 17 K. MULLER. Der EinfluB der Bestrahlungsbedingungen auf die Objektverschmutzung. 20 S. Leisegang und O. Schott 27 ijber ein Elektronenmikroskop mit universeller An- wendbarkeit fiir Elektronenbeugung. 30 H. Bethge A New Universal Electron Microscope of High Resolving Power: Metro-Vick Type EM6. 32 M. E. Haine and R. S. Page Uber ein neues elektrostatisches Gebrauchs-Elek- tronenmikroskop. 34 H. Mahl, H. Volkmann und W. Weitsch Bolzenkathode als Objekt im Elektronenemissions- mikroskop. 37 E. B. Bas 41 Summary of the Proceedings of a Symposium on X-Ray Microscopy and Microradiography, Cam- bridge University, England, August 16-21, 1956. 42 W. C. Nixon Uber die Entstehung des Kontrastes im elektronen- mikroskopischcn Bild (Invited paper). 60 B. v. Borrils und p. Lenz The DitVerential Scattering Cross Section of Atoms at Small Angles. 64 M. E. Haine and A. W. Agar Experimentelle Untersuchung dor Strcuung \on 70-kV-Elektronen an KohlenstotTin klcinstc \\ inkcl. 67 G. Kempf und p. Lenz Experimentelle Untersuchungen zum Kontrast diJnner Schichten im Elektronenmikroskop. 73 W. Lipfert Zur Veriinderung des Streuvermogens eincs Fest- korpers gegeniiber mittelschnellen Elektronen infolge lonisation und Anregung. 76 W. Scheffels Contraste de phase et contraste interchromatique. Etude comparee des methodes. 78 M. Locquin Der EinfluB von Temperatur. Unterlage und Be- deckung auf die Vcranderungelektronenmikroskopi- schcr Priiparate. 79 K. J. Hanszen IV. HIGH RESOLUTION ELECTRON MICRO- SCOPY AND ELECTRON DIFFRACTION Der Durchgang von Elektronenstrahlen durch das Kristallgitter und seine Folgen fiir das elektronen- mikroskopische Bild. 86 H. NiEHRS The Resolution of Crystal Lattices (Invited paper). 88 J. W. Menter Elektronenmikroskopische Abbildung von Kristall- gitterstrukturen. 93 R. Neider VIII Contents 107 Investigation of High Resolution Electron DitTrac- tion Patterns from Individual Micro-Crystals by Using a Three-Stage Electron Microscope. 98 W. D. RiECKE An Electron Microscope Examination of Freshly Prepared Silver loide Sols. R. Ottewill and R. W. Horne Y. SPECIMEN PREPARATION TECHNIQUES IN BIOLOGY AND MEDICINE Problems of Osmium Fixation. 106 G. F. Bahr, G. Bloom and U. Friberg The Quantitative Assay of Lipids Extracted from Untreated and OsOj-fixed Beef Brain. G. F. Bahr The Fixation of Nuclei in Locust Testis. 108 I. R. Gibbons and J. R. G. Bradfield Ultra-thin Sections of Avian Tubercle Bacilli in a New Embedding Medium. HI A. M. Glauert and E. M. Brieger The Use of Gelatin for Embedding Biological Ob- jects in Preparation of Ultrathin Sections for Elec- tron Microscopy. V. P. GiLiiv On the Preparation of Ultrathin Serial Sections by Means of a Watchmaker's Lathe. W. NiKLOWITZ How to Prepare Ultrathin Sections of Tissue Cul- tures. V. DOSTAL Eine einfache Vorrichtung zum Anspitzen von plexiglaseingebetteten Objekten. 1 1 8 A. Maas An Improved Method to Prepare Formvar Nets for Mounting Thin Sections for Electron Microscopy. 120 F. S. Sjostrand Experiments on Staining Thin-Sections for Electron 1 ''1 Microscopy. I. R. Gibbons and J. R. G. Bradfield Die Eignung und Anwendung von Phosphor- wolframsaure und Thalliumnitrat als Kontrastmittel zur Darstellung cytoplasmatischer Strukturen. 124 K. E. Wohlfarth-Bottermann The Use of the Electron Microscope to Control Preparation of Cellular Constituents. 125 M. S. C. BiRBECK and E. H. Mercher A Micro-manipulation Method for the Preparation of Calibrated Microdroplets over the Range 10-'=- 10-1" ml in Electron Microscopy. 127 Irene Sugar ijber die quantitative Spreitung von Zellen. Eine Untersuchung dunnster Filme mit dem Elektronen- mikroskop. 12° A. Kleinschmidt 113 115 117 The Effect of Acridine Type Dyes on the Submicro- scopical Structure of Large Molecules. 131 F. GuBA, G. Hajossi-Kerek and G. Romhanyi VI. CELL ULTRASTRUCTURE, GENERAL Mitochondria Elektronenmikroskopische Studien an Leberschnit- ten von Thyroxin-behandelten Ratten. 134 H. ScHULZ, H. Low, L. Ernster und F. S. Sjo- strand Die Entstehung, die Vermehrung und die Abschei- dung geformter Sekrete der Mitochondrien von 137 Paramecium. K. E. Wohlfarth-Bottermann Golgi Apparatus Changes in the Ultrastructure of the Ciliary Epi- thelium during Inhibition of the Secretion of 1 39 Aqueous Humour. A. HOLMBERG L'appareil de Golgi des protozoaires et son ultra- structure comparee a celle des metazoaires. 143 P. -P. Grasse The Morphology of the Golgi Apparatus in Neu- rones and Epithelial Cells of the Common Limpet Patella vulgata. 1^^ D. Lacy Cytoplasmic Basophilia Basophilic Structures in the Cytoplasm of the Sea Urchin Egg. B. A. Afzelius 147 150 151 Plasma Membrane Functional Changes of the Free Cell Surface Mem- brane of the Intestinal Absorbing Cell. F. S. Sjostrand and H. Zetterqvist The Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell and Its Histological Relationships. H. F. Parks Observations on Early Stages of Phagocytosis of Collodial Particles by Hepatic Phagocytes of the Mouse. H. F. Parks and A. D. Chiquoine The Role of Cell Membranes in Morphogenesis. 156 M. S. C. BiRBECK AND E. H. Mercer Electron Microscopic, X-Ray, and Birefringence Studies on the Proteins of the Hair Follicle. M. S. C. BiRBECK AND E. H. Mercer The Mechanism of Hemolysis Caused by Ultra- sonic Irradiation I. W. ROMANOWSKI, A. FeLTYNOWSKI AND J. LlTWIN The Mechanism of Hemolysis Caused by Ultra- sonic Irradiation II. W. ROMANOWSKI AND A. FELTYNOWSKI 158 161 Contents IX Cell Nucleus L'ultrastructure de la membrane nuclcairc dcs ovocytes de I'Araignee {Tegenariu doDicsiica C lerk). J. Andre et Ch. Rouiller Electron Microscopy on Grasshopper Spermatids. F. S. Sjostrand and B. A. Afzelius The Acrosomal Reaction of the Sea Urchin Sper- matozoon. B. A. Afzelius The Structure of Galea Capitis in Human Sperm. J. Schultz-Larsen and R. Hammen Thyroid Gland The Ultrastructure of the Thyroid Gland of the Mouse. R. Ekholm and F. S. Sjostrand Electron Microscopy of Chick Embryo Thyroid. R. Stole, P. Blanquet, A. P. Lachapele, R. Maraud and A. Magimel Kidney Preliminary Studies on the Development and Dif- ferentiation of Cells and Structures of the Renal Corpuscle. B. V. Hall and L. E. Roth Further Studies on the Nephron Ultrastructure in Mouse: Terminal Part of Proximal Convolution. J. Rhodin Adipose Tissue The Fine Structure of Brown Adipose Tissue in the Rat: with Observations on the Cytological Changes Following Starvation and Adrenalectomy. J. D. Lever VII. NERVE CELLS AND RECEPTORS Neurofilaments et neurofibrilles dans les fibres nerveuses de la Sangsue. R. COUTEAUX Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Grenzstrangganglien von nienschiichem Operations- material. Hedi Gansler Ultra-structure des cellules visuelles du Gecko. Mise en evidence de prolongements cytoplasmi- ques infra-microscopiques au niveau du segment interne. Nina Carasso Some Observations on the Structure of the Retinal Receptors of the Toad Eye as Revealed by the Electron Microscope. F. S. Sjostrand and L. G. Elfvin Submicroscopic Morphology of the Retinal Pig- ment Epithelium. G. Lion, C. Maertens and G. Vandermeerssche Preliminary Observations on the Ultrastructure of a Frog Muscle Spindle. 197 162 .1. D. Robertson 164 167 169 171 173 176 180 182 190 192 194 196 VIII. MUSCLE AND OTHER CONTRACTILE ELEMENTS Preliminary Observations on the Structure of Insect Flight Muscle. 202 H. E. Huxley and Jean Hanson The Ultrastructure of Skeletal Muscle Myofila- ments. 204 F. S. Sjostrand and Ebba Andersson The Tubular System in the Striated Muscle Cell. 208 Ebba Andersson Elektronenmikroskopische Untersuchungen am Ute- rusmuskel der Ratte. 210 Hedi Gansler Elektronenmikroskopische Untersuchungen iiber das Gewebe des glatten Muskels. 212 F. GuBA UND G. Hajossi-Kerek Mechanism of Pigment Migration uithin Teleost Melanophores. 213 S. Falk and J. Rhodin The Pharyngeal Protein Fibres of the Ciliates. 216 Ch. Rouiller, E. Faure-Fremiet and M. Gau- chery IX. COLLAGEN, CARTILAGE, BONE KoUagen (Invited paper). U. HoFMANN UND K. Kuhn 220 Neue Befunde zur Struktur der Sehnenfibrille an Hand von Dunnschnitten. 223 E. Kuhnke UND K. E. Wohlfarth-Bottermann The Proteolytic Action of Papain Studied by Means of the Electron Microscope. 225 G. Lelli and G. Arangio-Ruiz Electron Microscopic Observations on Frozen Col- lagen. 227 G. Lelli and G. Arangio-Ruiz Electron Microscopic Obser\a:ions on Collagen Exposed to X-Rays. 228 G. Lelli, U. Marotta and A. D'Amore Studies on the Fibrogenesis of Collagen. Sylvia Fitton Jackson 229 Further Observations on the Transformation of Collagen Fibrils into "Llastin". 230 M. K. Kfech and R. Reed Osteoarthritis of the Hip .loint. K. Little and L. H. Pimm 233 Correlation of Electron Microscopy with X-Ray DitTraction and Optical Birefringence in the Study of the Bone. 234 V. Caglioti, a. Ascenzi and A. Santoro Contents X. PATHOLOGY Elektronenmikroskopische Untersuchungen des ex- perimentellen Lungenodems. H. SCHULZ 240 Electron Microscope Studies on Alveolar Cells from Mammals. 244 A. PoLiCARD, A. Collet and S. Pregermain Vergleichende Untersuchungen der Mitochondrien in Rattenlungen nach intratrachealer Injektion von Kieselsaure. 246 W. KiKUTH, H. W. SCHLIPKOTER UND P. SCHROE- TELER The Lung Tissue in Mice Infected by Tubercle Bacilli. 248 B. Cedergren The Importance of an Accurate Size Determination of Fine Particles when Investigating Their Biological Effects. 250 G. Bloom, J. Glomme and A. Swensson Elektronenoptische Untersuchungen von Staub- korngroBen in Staublungen. 251 H. W. SCHLIPKOTER UND A. COLLI Electron Microscopy of the Glomerular Basement Membrane in Experimental Amyloidosis of the Mouse. 254 F. Miller and A. Bohle Electron Microscope Investigation on Biopsy Material from Patients with Renal Diseases: A Case of Subacute Glomerulonephritis. 256 A. Bergstrand and H. Bucht XI. MICROBIOLOGY Some Observations on the Structure of Tobacco Mosaic Virus. 260 H. E. Huxley Electron Microscope Studies on the Periodicity in Tobacco Mosaic Virus. 261 R. E. F. Matthews, R. W. Horne and E. M. Green Filamentous Forms of Influenza Viruses. 262 A. Feltynowski Fastening of Phage Particles to Bacterial Cell. 264 A. S. TiKHONENKO AND A. E. KrISS Filamentous Form of Bacteriophage at the Earliest Stages of Their Formation in a Bacterial Cell. 265 A. S. TiKHONENKO AND A. E. KrISS Comparative Studies on Sections of Intact Cells, Protoplasts, and "Ghosts" of a Bacillus Species. 266 C. Weibull AND K. G. Thorsson A Study of the T>\\\i\ono^ Saccharomyces cerevisiae Using Carbon Replicas. 268 D. E. Bradley XII. BOTANY Die Ontogenese der Chloroplasten von Cliloro- phytiiin comosum. 272 E. S. Perner Some Botanical Applications of the Carbon Re- plica Technique. 274 D. E. Bradley On the Ultrastructure of a Fungus: The Gametes of AUomyces. 276 G. TuRiAN and E. Kellenberger Elektronenmikroskopische Beobachtungen iiber die Warzenstruktur bei den Koniferen. 276 W. LlESE XIII. PAPER AND TEXTILE RESEARCH X-Ray Microscopy of Paper. 282 J. Isings, Ong Sin Poen, J. B. Le Poole and G. VAN NeDERVEEN Partial Embedding Technique for Replication of Fibres. 283 J. Dlugosz A Method for the Carbon Replication of Extensive Areas of Very Irregular Surfaces, with Particular Application to the Study of Pulp Fibres, Wood and Paper. 285 D. H. Page Further Reflection Electron Microscopy of Pulp Fibres and Paper. 287 H. W. Emerton, D. H. Page and J. Watts Application of Ultra-Microtomy to the Fine Structure Study of Rayon Viscose Fibre. 290 P. Kassenbeck Structural Details of Natural Fibers as Observed with the Electron Microscope. 292 C. Maertens, G. Raes and G. Vandermeerssche Contact Region between Two Fibres. 293 Saara Asunmaa Die elektronenmikroskopische Darstellung groBer Perioden in Cellulosefasern durch Einlagerung schwerer Atome. 295 K. Hess On the Submicroscopic Structure of Mannans. 298 H. Meier A Contribution to the Structure of Keratin. 300 M. W. Andrews and J. Sikorski The Electron Microscopy of Pigmented Keratinous Materials. ^^^ J. Hope, J. Sikorski and C. S. Whewell iJber den Feinbau der Spinnenfiiden. 307 R. LeHMENSICK UND E. KULLMANN Contents XI XIV. METALLOGRAPHY AND OTHLR INDUSTRIAL APPLICATIONS Direct Observation of Dislocations and Their Movement in Metal Foils. 312 P. B. HiRSCH, R. W. HoRNE AND M. .1. Whelan Dislocations in Stainless Steel. 316 W. BOLLMANN Migrations of Grain Boundaries Studied with the Electronic Emission Microscope. 318 R. Arnal and M. Sorel Perlit- und Bainitgefuge in drei KohlenstoflTstahlen mit 0, 1 8 "o, 0,50 "„ und 0,86 % C. 319 S. MODIN Selective Oxidation due to the Heating of the Evaporated Film of a-Brass. 322 N. TaKAHASHI AND K. MlHAMA The Electropolishing of Aluminium. 324 A. W. Agar and R. S. M. Revell Zur Anwendung eines neuartigen elektrolytischen Poliergerates. 326 R. Zetzsche, E. Guyenot und H. J. Proger Llektronenoptische Untersuchungen an metallur- gischen Stauben, insbesondere deren Praparation und physikalische Differenzierung. 328 A. M. D'Ans und L. von Bogdandy The Electron Microscope in the Study of Wear. 331 D. Scott and H. M. Scott Anwendungen der Mikrotomschnitt-Technik auf elektronenmikroskopische Mineraluntersuchungen. 333 G. Prefferkorn, H. Themann und H. Urban The Use of a Freeze-drying Technique in the In- vestigation of Sodium-Montmorillonite by Electron Microscopy. 334 H. C. Corbet and J. Wolffes Zur Kenntnis der Glasoberfliiche. E. BkiJCHE und H. Poppa 336 Elektronenoptische Untersuchung natiirlichcr Opale in Verbindung mit ditVcrcntiallhermischen und ront- genographischen Studien Liber die Polytypic des SiO.,. 339 A. Maa.s A Reflection Electron Microscope Study of Dia- mond Cleavage Surfaces. 341 M. Seal The Direct Observation in the Scanning Micro- scope of Chemical Reactions. 343 J. H. L. McAusLAN AND K. C. A. Smith Uber das Teilchenwachstum sublimierbarer StofTe, dargestelll am Beispicl des Zinksulfids. 346 W. M Ciller und W. Jaenicke Electron-microscopical Investigations of Calcium Hydroxide and Calcium Carbonate. 347 G. SCHIMMEL Further Investigations of Photographic Develop- ment by Means of the Electron Microscope. 349 E. Klein Gelatin in the Photographic Process. 351 G. Vandermeerssche, C. Maertens and G. Lion The Microstructure of Photoconducti\e PbTe Layers. 352 A. Feltvnowski, J. Glass and L. Grelewicz Identification of Minerals Present in Mine Dusts by Electron Diflfraction and Electron Microscopy. 353 .1. H. Talbot ,<.^>^^^^ *'^^A/ M1C\-^"'" During four busy days, from the 17th to the 20th of September 1956, a conference on electron mi- croscopy was held at the Karolinska Institute in Stockholm. The conference was organized in about seven months by the Scandinavian Electron Mi- croscope Society at the request of the International Federation of Electron Microscope Societies. It represented the first European regional conference arranged under the auspices of this federation. The organizing committee consisted of the Com- mittee of the Scandinavian Electron Microscope Society with the addition of a few other members of that society. Financial support for the conference has been granted by the Swedish Government through the Minister of Education, Mr. I. Persson, and through the State Research Councils on Agriculture, Natural Sciences, and Technology. The members of the organizing committee express their appreciation for this important support. When the conference was opened by the Rector of the Karolinska Institute, Professor S. Friberg, it proved to have attracted 370 participants from 27 countries (see the list overleaf). The number of participants and of papers by far exceeded what had seemed reasonable to expect for a regional conference. In fact, with 176 papers read, this conference represented the largest meeting of electron microscopists ever held. It proved to be a difficult problem to squeeze this program into the time limits. An unavoidable consequence was to run mostly two and, temporarily, three parallel sessions. An extensive and representative exhibition of electron micrographs and of electron microscopes and accessories had been arranged. The participants had the opportunity of seeing the following types of electron microscopes in performance: Akashi Troncoscope, Philips EM 100 B and EM 75 B, RCA EMU 2 and EMU 3c, Siemens Elmiskop I, and the prototype of the new Zeiss electrostatic microscope. The tragic death of Professor Bodo von Borrics on July 17, 1956, overshadowed the conference. In commemorative addresses. Dr. V. E. Cosslett, Sec- retary of the International Federation of Electron Microscope Societies, and Professor E. Ruska, hon- oured his pioneer work in electron microscopy. On a proposal of Dr. J. Hillier, this conference will be referred to as the "Bodo von Borries Memorial Conference". The Proceedings of the Stockholm conference have been edited with two major aims: to have the proceedings in print in the shortest possible time, and to keep their size within reasonable limits. We have therefore had to cut down the editorial work, to exclude summaries, to restrict the space available for pictures, and to shorten the texts of several papers. We feel that a great deal more could have been done from an editorial point of view. These Proceedings are dedicated to the Memory of Bodo von Borries, in accordance with a proposal made by Dr. J. Hillier and by the decision of the Committee of the Scandinavian Electron Microscope Society. Stockholm, February 1957 Fritiof S. Sjostrand 1 — 568204 Electron Microscopy ORGANIZING COMMITTEE of the Stockholm Conference on Electron Microscopy President Dr. F. S. Sjostrand Secretary Dr. J. Rhodin Assistant Secretary Mrs. Elisabeth Johannesson Treasurer Mr. Ove Nilsson Members Mr. A. Birch-Andersen Prof. A. Engstrom Dr. H. Engstrom Prof. G. Glimstedt COUNTRIES REPRESENTED at the Stockholm Conference on Electron Microscopy Number of participants in parentheses Argentina (1) Australia (1) Austria (4) Belgium (5) Czechoslovakia (3) Denmark (9) Finland (4) France (31) Germany [Eastern] (13) Germany [Western] (99) Great Britain (40) Holland (20) Hungary (2) Ireland (1) Italy (11) Japan (2) Norway (3) Poland (1) Portugal (1) Soviet Union (8) South Africa (1) Spain (6) Sweden (72) Switzerland (12) Turkey (1) United States (17> Yugoslavia (2) BODO VON BORRTES 1905-1956 Am 17. Juli 1956 verschied unerwartet in seinem 52. Lebensjahr nach kurzer schwerer Krankheit der Pionier der Elektronenmikroskopie Prof. Dr.-Ing. habil. BoDO v. Borries. Der Verstorbene wurde am 22. Mai 1905 in Her- ford als Sohn des dortigen Landrats geboren und wandte sich — wohl durch sein mUtterliches Erbe bestimmt — der technischen Wissenschaft zu. Er studierte in Karlsruhe, Danzig und Munchen Elek- trotechnik und wurde 1930 wissenschaftlicher As- sistent von Prof. A. Matthias am Hochspannungs- institut der Technischen Hochschule Berlin, an dem eine von M. Knoll geleitete Arbeitsgruppe sich mit der Physik und Technik des Elektronenstrahl- oszillographen beschiiftigte. 1932 promovicrte er dort mit einer Arbeit Liber die ,,AuBenaufnahme am Kathodenstrahloszillographen". Wahrend seiner Doktorandenzeit begannen ihn die Aussichten zu fesseln, die sich damals der Forschung durch die Moglichkeit erolTneten, Elektro- nenstrahlen zur Mikroskopie zu verwcnden. Er wandte sich daher bald elektronenoptischen Unter- suchungen zu und betrat so in jungen Jahren den Weg, auf dem er bis zuletzt in uncrmiidlicher wissen- schaftlicher, technischer und organisatorischer Tiitig- keit so fruchtbare Arbeit leisten solltc. Die zu jenerZeit von verschiedener Seite auf dem Gebiet der Elektronenmikroskopie erzielten — zumindest ermutigenden — theoretischen und experimentellen Ergebnisse hatten noch kcineswegs vermocht, die Bedcnken und psychologischen Hcmmungcn zu iiberwinden, die sowohl bei Phy- sikern als auch bei anderen das Lichtmikroskop benutzcndcn Forschcrn gegenijber der neuen Mc- thodc bestanden. Dadurch war es zuniichst nicht moglich, die erfordcrlichen erheblichcn Mittel fur einc intensive Entwicklung dieses Gebietes von wis- senschaftlicher odcr industricller Seite zu crhalten. B. V. BoRRiLS hat schon fruh die grol3c Bedcutung der Elektronenmikroskopie mit klarem Blick erkannt und sich in Wort und Schrift mit seiner ganzen iiberzeugenden Pcrsonlichkcit fiir ihre Forderung eingesctzt. Ein erster entscheidender Erfolg war diesen Bemuhungen beschieden, als das Haus Siemens ihm und dem Referenten Ende 1936 die Moglichkeit Bodo von Barries bot, Elektronenmikroskope fiir die Praxis zu entwickeln. Unsere 1937 bei Siemens beginnende gemeinsame Arbeit wurde bald darauf noch durch H. RusKA unterstiitzt, der als Mediziner die sich abzeichnende Erweiterung der mikroskopischen Moglichkeiten schon seit Jahren verfolgt hatte. Als Frucht dieser Zusammenarbeit konnte das Friah- stadium der Experimente und Versuchsanordnungen iiberwunden und Ende 1939 das erste serienmaBige Elektronenmikroskop in einem Forschungslabora- torium der IG-Farben in Hochst in Betrieb genom- men werden. Neben der Vervollkommnung des Durchstrah- lungsmikroskops widmete sich v. Borries besonders auch der Verbesserung des Riickstrahlungsprinzips. Es gelang ihm dabei erstmals, Oberflachen von Metallproben mit besserer als lichtmikroskopischer Auflosung elektronenmikroskopisch sichtbar zu machen, wodurch er die bisher auf durchstrahlbare, d.h. sehr diinne Objekte beschrankte Elektronen- mikroskopie aufs glijcklichste erganzte. In den letz- ten Kriegsjahren begann er dann — ankniipfend an seine friihen Arbeiten uber die Elektronenemp- findlichkeit photographischer Flatten — mit syste- matischen Untersuchungen der energetischen Wech- selwirkungen im Elektronenmikroskop, mit denen er sich im Friihjahr 1945 an der Technischen Hoch- schule Berlin habilitierte. Fiir seine Verdienste erhielt v. Borries 1941 die Silberne Leibnizmedaille der PreuBischen Akademie der Wissenschaften. Als wahrend der Kriegsjahre die Fortfuhrung der elektronenmikroskopischen Arbeiten wegen der fiir dringlicher gehaltenen Entwicklungen und Fabrika- tionen immer aufs neue in Frage gestellt wurde, kampfte er mit erfolgreicher Hartnackigkeit fiir das Bestehenbleiben dieser Arbeitsstiitte, so daB bis Februar 1945 etwa 35 Elektronenmikroskope in wissenschaftlichen und industriellen Forschungs- instituten aufgcstellt werden konnten. Das Kriegsende verschlug ihn mit seiner Familie und einigen Berliner Mitarbeitern in seine west- falische Heimat. Dort legte er die bisher erarbeiteten Kenntnisse und Erfahrungen in dem 1949 im Verlag W. Saenger erschienenen Buch ,,Die Ubermikro- skopie" nieder. In diesem Werk untersucht er ins- besondere die Leistungsgrenzen der Elektronen- mikroskopie, welche durch die energetischen Ver- hiiltnisse in der Elektronenstrahlquelle, am Objekt und auf dem Leuchtschirm sowie auf der photo- graphischen Platte gegeben sind. Fine Kliirung dieser Fragen ist fiir die Elektronenmikroskopie von groBer Bedeutung, weil sic nicht nur die Ent- stehung elektronenoptischer Bilder verstandlich macht und ihre Deutung und Auswertung ermoglicht, sondern weil sie auch erkennen liiBt, auf welchen Wegen man die Mikroskopie mittels Elektronen- strahlen bis zur Sichtbarmachung einzelner Molekiile bzw. Atome vervollkommnen kann. Mit Tatkraft und Umsicht setzte er sich in den schwierigen Nachkriegsjahren fiir die Weiterfuhrung der elektronenmikroskopischen Forschung ein. Auf seine Initiative wurde 1948 die ,,Gesellschaft fiir Ubermikroskopie e. V. zu Diisseldorf" ins Leben gerufen, der die Ministerien fiir Kultus und Wirt- schaft des Landes Nordrhein-Westfalen und ver- schiedene industrielle Unternehmungen angehorten. Diese griindete und betrieb dann das .,Rheinisch- Westfalische Institut fiir Ubermikroskopie", das er als Direktor leitete. Aus diesem Institut, das sowohl der Weiterentwicklung des Elektronen- mikroskops selbst als auch seiner Anwendung auf mannigfachen Gebieten dienen sollte, sind von ihm, seinen Mitarbeitern und den wissenschaftlichen Gasten viele wertvolle Arbeiten verofTentlicht wor- den. Sein personliches Interesse wandte sich ins- besondere der Berechnung und Konstruktion von permanentmagnetischen Elektronenlinsen zu, bei deren Verwendung die bisher erforderlichen Strom- quellen hoher Konstanz fortfallen. Er entwickelte in seinem Institut mit neuen Konstruktionsideen ein leistungsfahiges magnetostatisches Elektronenmi- kroskop. Spiiter wurde von ihm und seinen Mit- arbeitern ein Ultramikrotom neuer Bauart verofTent- licht, das sich inzwischen ebenfalls gut bewiihrt hat. Schon friih hat sich B. v. Borries mit der Frage auseinandergesetzt, auf welchen Wegen eine inten- sive und universelle Auswirkung der Elektronen- mikroskopie in der naturwissenschaftlichen Grund- lagenforschung und in ihren speciellen Anwendungen zu erreichen ware. Hierbei war ofFensichtlich der zu groBe Aufwand fiir die Beschaffung und den Betrieb eines Elektronenmikroskops hinderlich. Er hat daher versucht, rationellere konstruktive Losungen fiir die Geriite zu finden und so zu einer Senkung der Kosten beizutragen. Notwendig war es auch, an mikro- skopischen Forschungen interessierte Wissenschaft- ler verschiedener Fachgebiete zusammenzubringen, um die Probleme der bis in die GroBenordnung der Molekiile und Atome vordringenden neuen Mikro- skopie zu erortern und ihre Einfiihrung und breite Anwendung durch stiindigen Erfahrungsaustausch zu fordern. Ihm ist es an erster Stelle zu danken, daB nach dem Krieg die Deutsche Gesellschaft fiir Elektronenmikroskopie gegriindet wurde, die er — zuerst als verantwortlicher Schriftfiihrer und dann als Geschaftsfuhrender Vorsitzender — umsichtig und verantwortungsbewuBt bis zu seinem Tod geleitet hat. Mit dem Ziel, die Veroffentlichung elektronenmikroskopischer Ergebnisse starker als bisher in einem hierfiir besonders geeigneten Organ zu konzentrieren, hat er sich erfolgreich mit dafiir eingesetzt, daB die Zeitschrift fiir wissenschaftliche Mikroskopie und mikroskopische Technik, die nach dem Krieg — wie viele andere — aus wirtschaftlichen Griinden ihr Erscheinen einstellen muBte, wieder fortgefuhrt und durch einen elektronenmikrosko- pischen Teil erweitert wurde. Auf vielen in- und auslandischen Kongressen hat er die Interessen un- seres Faches vertreten und die internationale Zu- sammenarbeit gefordert. Bei der Grundung der Bodo von Borries International Federation of Electron Microscope Societies 1954 in London wiihlten ihn die Delcgierten der auslandischen Gesellschai'ten in Anerkennung seiner wissenschaftlichcn und organisatorischen Leistungen und Faliigkeilen zum Priisidenten. B. V. BoRRits tuhlte sich in erster Linie als Inge- nieur, und in der Tat entsprangen seine Leistungen der Synthese von wissenschaftlichem, technischem und wirtschaftlichem Denken und SchafTen. Seine Liebe gait ganz besonders dem Konstruiercn. Er wurde 1949 als Honorarproi'essor an die Medi- zinische Akademie zu Diisseldorf und 1953 als ordentlicher Professor auf den neugeschatrenen Lehrstuhl fiir Elektronenoptik und Feinmcchanik der Technischen Hochschule Aachen berufen und konnte so — wenn auch nur noch wenige Jahre — seine reichen Erfahrungen als ein selbst begeisterter und daher mitreiBender Lehrer an die jiingere Generation weitergeben. Seinen Studenten und Mitarbeitern gab er nicht nur vielfiiltige Anregungen, sondern brachte ihnen auch ein warmes menschliches Interesse entgegen und half ihnen in personlichen Schwierigkeiten mit Rat und Tat. B. \. BoRKii s hat die Flektronenmikroskopie seit ihrem Entstchen uber 25 Jahre lang leidenschaftlich uiul unermiidlich gefordert. Seelischen Ausgleich fijr seine dauernde geistigc Anspannung suchte und fand er in oinem harmonischen Familienlcbcn. Mit groBer Liebc hing er an seiner Lebensgefahrtin und an seinen fiinf Kindern, denen er ein verstiind- nisvoller Vater imd Freund war. Er schiitzte und ptlegte die hiiusliche Gcsclligkeit und verbrachte auch auf den elcktroncnmikroskopischen Tagungcn im in- und Ausland mit den Fachgenosscn manchc frohe und beschvvingtc Stunden. Ls erfiilltc liiii dabei mit groBer Genugtuung, daB sich in so viclen Liindern der Kreis clektronenmikroskopisch ar- beitcndcr Kollegen von Jahr zu Jahr sichtlich vergroBcrtc. Wir Freunde und Kollegen bedauern zutiefst den so unerwartct friihen Tod dcs aktivsten Vorkiimpfers der Flektronenmikroskopie, dessen Pcrsonlichkcit und Lebensleistung uns unvergeBlich bleiben werden. Auch seine Schiiler und engcrcn Mitarbeiter werden ihren Lehrer und Forderer in dankbarer Erinnerung behalten. It is my sorrowful duty and privilege to recall to you the untimely passing, after a short illness and serious operation, of the President of our Interna- tional Federation of Electron Microscope Societies. It is sad, sad almost beyond words, that we must commence this meeting under the shadow of the death of the man who would have been presiding here, had he but lived. Professor von Borries had worked hard to prepare the way for this Congress — I believe it is correct to say that the idea of holding Regional Meetings, between the larger World Con- ferences, was his in the first place, and he was very much concerned to make a success of the first gathering of this kind. Could he have been with us this morning, I am sure he would have agreed that in attendance and volume of contributions it has exceeded his highest expectations. Bodo von Borries has been one of the chief founders of electron microscopy in the strictly scien- tific as well as in the organisational sphere, it should be known to even the youngest of our members how he was successful, with Dr. Ernst Ruska, in obtaining in 1932 the first transmission pictures with an electron microscope. From that time on. the collaboration of von Borries and Ruska continued the development first of the electron microscope in the research laboratories of the Technical University of Charlottenburg and then of the original model for the firm of Siemens and Halske. He occupied himself with the applications as well as the design and operation of the instrument, and was especially interested in explaining its principles and potenti- alities to wider scientific and semi-scientific audiences. After 1945 he had a long and hard struggle to get a laboratory established again for independent re- search in the subject. It is a remarkable tribute to his vision and ability that he finally successfuli\ formed and financed, almost entirely b\ his own efforts, the Rheinisch-Westfiilische Institut fur Uber- mikroskopie in Diisseldorf. This must be almost unique of its kind in the world, being, so far as I know, the only independent research centre for electron microscopy, financed on a very wide basis from state, industrial and philanthropic sources, and established and directed by one man. And at the same time he was actively promoting the organi- sation of electron microscopy in Germany and on the international level. Others can speak with better knowledge than myself of the part he played in setting up and carrying on the Deutsche Gesellschaft fur Flektronenmikroskopie, but it is evident that that Society has largely bcL-n inspired by him and without his constant activity on its behalf would not now be the large and influential body that it is. He was its main founder, and at his death was its executive President. I mention almost as an aside that he was Professor vi\ electron microscopy at the Technische Hochschule at Aachen, at the same lime Bodo von Borries as he was directing the Institute in Dusseldorf and fulfilling a number of other functions in educational and scientific bodies. In the international sphere von Borries was also most active, and deeply concerned to establish good scientific relations with electron microscopists in other countries, despite the deep wounds caused by the War. He visited us in Britain in 1948 and ever since that time has worked hard to set up an effective international organisation for electron microscopy, and to ensure that his own country played a full part in it. I need not remind you that he was elected first President of the Joint Commission for Electron Microscopy that was set up at the London Confer- ence in 1954. When that body was in effect vetoed by the International Council of Scientific Unions he was most concerned that all the ground work put into it should not go wasted and that some viable organisation should be established as quickly as possible. He played a major part in the transfor- mation of the Joint Commission into the Interna- tional Federation of Electron Microscope Societies, and was its first President, in this capacity he worked unceasingly for the extension of the Federa- tion's activities, for the success of the Regional Conferences being held for the first time this year, and in preparing for the next World Congress in 1958, which was to be held in his country. At the time of his death he was planning to visit Japan during October, to attend the Regional Congress for Asia and Oceania, at which he was to have given the opening address. By his untimely end. in the midst of full creative activity, the young science of electron microscopy has lost one of its greatest exponents and indeed one of its two original pioneers. Germany has lost the founder and mainspring of its electron micro- scope society and the International Federation its first president and chief advocate. I commend his career to you as an outstanding example of service to science in its fundamental, applied, educational and organisational aspects equally. Let us honour his memory by continuing to advance the aims and ideals he followed, particularly in developing the poten- tialities of electron microscopy in Science and tech- nology, nationally and internationally. We mourn the death, but we salute the memory of Bodo von Borries, pioneer of electron microscopy and first President of our International Federation. I INSTRUMENTATION Observation directe des surfaces metalliques par reflexion C. Fert Labor atoire d'Optiqiie Electroniqiie, Toulouse Au cours des dernieres annees, I'observation directe des surfaces par reflexion d'electrons a donne lieu a diverses recherches, et plusieurs communications de ce congres sont consacrees aux applications de cette methode. Je desire presenter ce probleme du point de vue du physicien, en insistant sur les faits nouveaux depuis le Congres de Londres (1954). Generalites. — Dans un microscope electronique par « reflexion », Tobjet est « eclaire » par un faisceau d'electrons monocinetiques. Les electrons diffuses dans la direction de Tobjectif servent a la formation de I'imagei. L'axe du faisceau qui eclaire I'objet est incline par rapport a Taxe de Tobjectif d'un angle d^ -r 0, (fig. 1). L'objet est eclaire sous un angle 0^ (angle d'eclaire- ment). La surface de Tobjet fait avec l'axe de I'objectif un angle 6. (angle d'observation). Angle 02 et distorsion de I'image : L'image qui se forme sur I'ecran est celle de la projection de la surface de l'objet sur le plan de front conjugue de I'ecran. Soit Mi le grandissement. Si un quadrillage carre de cote a est trace sur ^objet^ l'image de chaque carre est un rectangle de cote Mi a et M^ sin Oo a. On parle de deux grandissements caracte- ristiques Mj et M. = Mi/sin 6.,. On peut dire que le rapport M2/M1 = sin d.^ caracterise une « distorsion » de l'image. Angle 61 et sensibilite au relief : Nous verrons que 6*1 est toujours petit devant (I. ■ I'eclairage est tres rasant. Les asperites de l'objet portent ombre sur sa surfaced Si 0^ est tres petit, les ombres sont tres l=h sin (Oi + gg) sin Oi allongees, la sensibilite au relief tres bonne : une asperite de quelques millimicrons est mise en evi- dence. Cette cause de contraste est preponderante devant toutes les autres, ce qui distingue nettement la microscopic electronique par reflexion d'autres methodes d'observation directe des surfaces (micros- cope Electronique a emission par exemple). Influence de 0^ et d, sur la resolution : Micros- copic electronique par reflexion sous grand angle. — Jusqu'en 1954, la seule technique utilisee etait celle de ['observation rasante* : 0., petit, de I'ordre de 4 a 6°, M1/M2 de I'ordre de 10 a 15; dans ces condi- tions, la distorsion des images est tres genante, mais il etait admis que si 0, etait plus grand la dispersion des vitesses des electrons diffuses devenait importante et la resolution mauvaise^ Canon a electrons y*^ Condenseur Canon a ions Objet Objectif Diaphragme d'objectif Diaphragme de selection Lentille intermediaire (Systeme dispersif) r Projecteur Groupe quadripolaire (anamorphose) Ecran fluorescent Emulsion ^ ^ n r 6^ Binoculaire Fig. 1. Direct observation of solid surfaces by reflection. Apparatus. Nous avons cherche a determiner experimentale- ment I'influence reelle de 62. A notre surprise, I'experience a montre que, si l'objet est tres propre, tres peu corrode et le faisceau incident rasant (0i petit, 1 a 3 par exemple), la resolution ne varie pas, pour une ouverture donnee, si 02 augmente. Elle est, par exemple, voisine de 300 A pour une ouverture 2a =5 10"^ radians, pour la plupart des echantillons examines. ^ Le premier essai demicroscopieelectroniqueparreflexion est du a Ruska (5). 2 On suppose que un cote est oriente perpendiculairement au plan d'incidence. ' La longueur apparente, en projection sur le plan de front conjugue de Tecran, de Fombre d'une asperite de hau- teur Il est * Voir par exemple : Dupouy et Fert, Congres de Londres (1954). La premiere publication sur cette technique est celle de von Borries (1). * Dans le microscope electronique par retlexion, c'est I'aberration chromatique de Tobjectif qui limite la resolution. Observation directe des surfaces metallk/ues Kig. 2. White pearlitic cast-iron etched by cathode sputtering. Experimental conditions: Oj =^ 2°, 02= 23 : ratio ol'theciiarac- teristic magnitkations: 2.5. Objective focal length/^ 3.5 mm. Objective diaphragm: 2 r = 30 microns. Direct magnification: 1800. Exposure time: 15 seconds. This photograph has been obtained by joining together three photographs which were taken with slightly dilTerent focusing, corresponding to a knov\n variation ofthe resistance \\hich is placed in series u ith the objective. Autrement dit : si 0^ reste petit, la dispersion des vitesses des electrons difTuses n'augmente pas sen- siblement avec 0,.' L'emploi de grands angles d'observation (0. 15 ) ^ Pour preciser ce resultat, nous faisons actuellcment une etude experimental directe de cette dispersion en fonction de Oi et 02 par spectrographie des vitesses electroniques; I'element dispersif (en pointille sur la fig. 1) est monte sur le microscope electronique par reflexion, el permet d'obtenir le spectre des vitesses des electrons diffuses par une region choisie de I'objet. - Diverses consequences resultent de Temploi de grandes valeurs deSg • bande de nettcte plus large, sensibiliteau relief plus grande etc... Nous n'insistons pas ici sur ces resultats, qu"il est facile de prevoir (4). change completement Taspect des images. Nous avons principalcmcnt utilise des valeurs de Oi •- Sj = 25 , soit 0., ly. La figure 2 montrc une image obtcnuc dans ces conditions. Le rapport A/, A/.., caractoristiquc de la distorsion des images, est A/, M. 2.5 au lieu de 15 pour 0., - 4 .- Reduction de la distorsion des images par une leniille correctrice. — Pour rcduire encore davantage cette distorsion (quel que soit 0,), nous avons en outre utilise I'artifice suivant. Un systeme a symctrie non axiale est dispose apres Ic projecteur. Son role est d'augmenter le grandisscment dans le plan d"incidence, et de le reduire dans le plan iicrpcndiciilairc (3). 10 C. PERT Fig. 3. Correcting lens operating. The specimen is an eletrolytic deposit of Nicivel on cast-iron. The two parts of this figure represent the same region of the specimen with and without correcting lens. Observation directe des surfaces metallic/ues 11 Fig. 4. Austenitic steel, di-r 6^= 25°: with correcting lens, M^j Mi= 1.3. Nous avons obtenu d'abord ce resultat avec une lentille electronique spherocylindrique. Nous utili- sons maintenant un groupe quadrupolaire magne- tique (fig. 1) convenablement oriente. Si / est le courant d'excitation des bobines de ce systeme, le rapport Mi M, devient^ : Ml Mo 1 1 CO I sin 0, \ + coi (o), coefficient caracteristique du groupe quadrupo- laire). Les figures 3 a 5 ont ete obtenue dans ces conditions, pour 6, = 23° (Fig. 3), + = 25° (Fig. 4), 12 (Fig. 5). Cet artifice reste evidemment valable pour des valeurs plus petites de 0.. qui prescntcnt Tavantage de donner des images mieux eclairees, ou de per- mettre la micro diffraction. II facilite toujours bcau- ^ L'expression de la longueur appurcnte d'Line ombre portee prend la forme : l=h sin {(Ji + Oi) 1 -.oji sin Oi I -co i "impression de relief est augmentee. coup Tobservation des images ou rintcrprctation des photographies. Description de I'appareil. — La figure I precise le montage. On notera : Le canon a ions: Ic bombardemcnt ionique de Techantillon evite sa contamination (2). Le diaphragme de selection qui limite la region de I'objet si on veut obtenir soit le diaphragme de diffraction de cettc region (0., petit), soit le spectre des vitesses des electrons diffuses par cette region. Le groupe quadrupolaire corrccteur. L'ecran fluorescent incline qui assure une cor- rection complementaire de la distorsion de Timage, dans Tobservation visuelle. Cet ecran est relalive- ment c'loii;ne de I' emulsion afin d'observer une image a grandissement reduit, done plus eclairee. Nos efforts se poursuivent actuellement atin d'ame- liorer la resolution ct reclairemcnt des images par : (a) Temploi d'une difference de potent iel accele- ratrice plus elevee, afin d'augmenler la hnllance de la source, et, peut-etre, de reduire A V/V. (h) i'emploi de systemes correcteurs de Taberra- tion chromatique. a symetrie non axiale. Conclusion. — La microscopic electronique par reflexion est possible pour une tres large gamme des valeurs de Tangle d"observation, a resolution sensi- 12 V. E. COSSLETT AND P. DUNCUMB Fig. 5. White pearlitic cast-iron. Oj + 0, ' magnification: 1000. 14'', 02= 12', with correcting lens, M^l M.,= 3. Exposure time: 3 seconds. Direct blement constante. Elle presente une sensibilite au relief comparable a celle des methodes optiques in- terferentielles ou par contraste de phase, tout en ayant une limite de resolution dix fois meilleure en- viron, dans les conditions actuelles. Ces caracteristi- ques essentielles, fixeront, sans aucun doute. le domaine propre d'utilisation de la microscopic eiec- tronique par reflexion dans Tobservation directe des surfaces. BiBLIOGRAPHlE 1. VON BoRRiES, B.,Z. Physik 116, 370 (1940). 2. Pert, Ch., Compt. rend. acad. sci. 248, 333 (1954). 3. Pert, Ch. et Marty, B., Compt. rend. acad. scl. 241. 1454 (1955) 4. Pert, Ch., Marty, B. et Laporte, R., Comptes rendus du colloqiie CNRS a Toulouse, Avril 1955. 5. RusKA, E., Z. Pliysik 83, 492 (1933). A Scanning Microscope with either Electron or X-Ray Recording V. E. CossLETT and P. Duncumb Cavendish Laboratory, Cambridge 1 HE purpose of the scanning microscope is to form an image of a surface either by electron scattering or by x-ray emission, and to analyse the elements in a selected volume of about one cubic micron in the surface by the characteristic x-ray lines emitted. A block diagram of the apparatus is shown in lenses into a small spot on the specimen, using a similar technique to the x-ray projection microscope (4, 6), and is scanned over the specimen by the deflec- tion coils. These coils are similar to those used by McMullan and Smith in their scanning electron microscope (5, 7), and give the beam a double deflec- fig. 1. The electron beam is focussed by two magnetic tion balanced so that the beam always goes through A Scanning Microscope with Electron or X-Ray Recording 13 DISPLAT r l— «nPLIFIER g - ELECTRON! GUN MftGMETIC LENSES CRYSTAL SPECTROMETER 'MAY Be INSERTED AMPLIFIER PULSE ANALYSER Fig. 1. Block diagram of the scanning microscope. the lens aperture. The spot size is 0. 1 /< to 1 // and the area of scan about \ mm square at largest. Part of the emitted x-rays are collected through a window in the polepiece gap by a scintillation counter, or alternatively the phosphor of the counter may be pushed into the vacuum to record high energy scat- tered electrons. The amplified signal from the counter modulates the brightness of a cathode ray tube scanned in synchronism with the microscope beam, so that an image is obtained of the variation of scattered electron intensity or of x-ray emission over the surface. The scan may then be stopped and the micro- scope beam accurately positioned on any feature in the specimen by observing the spot on the afterglow of the picture on the display tube. Through another window part of the emitted x-rays pass into a crystal spectrometer for analysis of the emission spectrum from that point, as in the method of microanalysis developed by Castaing (I, 2). Alternatively, the crystal can be removed from the spectrometer so that the x-rays pass straight into a proportional counter, which gives for each quan- tum a pulse of height approximately proportional to its energy. A single channel pulse analyser can be used to pass only pulses corresponding to a given characteristic line and, with the beam scanning, these can modulate the display tube so that the distribution of the element emitting that line is shown up. The second lens is shown in fig. 2. The electrons are focussed on to the specimen which is level with the lower pole face, and x-rays pass through a beryllium window into the phosphor of the scintilla- tion counter just outside the gap. The light generated is transmitted by a perspex rod to the photocathode of the multiplier outside the lens. The electrons scattered from the specimen are deflected by the lens field, but may be collected by removing the window and pushing the phosphor into the polepiece gap. The signal from the photomultiplier with elec- tron recording is several hundred times that with x-ray recording with other conditions unaltered. Through another window in the polepiece gap x-rays pass into a hydrogen filled tube and into the crystal spectrometer or proportional counter. The 1 SPECIMEN MOVEMENTS Fig. 2. Final lens. specimen can be moved laterally and vertically or rotated and is insulated from earth in order to meas- ure the incident electron current. The focal length of the lens is about 4 mm; this is slightly short- ened by a thick ferromagnetic specimen but the spot is not distorted. Fig. 3 shows an area of 1500 mesh/inch silver grid as photographed from the display tube with electron collection in A and x-ray in B. The accelerating volt- age was 25 kV giving an electron penetration in the specimen of about 1 //. The topography of the bars is shown up with electron collection (A) but not with x-ray collection (B) unless the irregularities are more than a few microns in size. With x-ray collec- tion the resolution can be no better than the electron penetration since x-rays are emitted throughout the volume of electron diffusion, but with electron collec- tion the resolution is well below this. Smith reports a resolution of about 200 A with his scanning microscope (7). The particular advantage in using x-rays to form the picture lies in being able to show up the distribu- tion of one element by using a proportional counter and pulse analyser. For example, with a specimen of silver and copper grids it is possible to make either one appear the brighter by selecting the CuK A B Fig. 3. 1500 mesh inch silver grid, bars .^ /( and I \ /i wide. A, electron collection; B, x-ray collection. 14 B. V. BORRIES ti G. LANGNER AND W. SCHEFFELS D Fig. 4. Impurities in beryllium foil, x-ray collection. A, all radiation recorded; B. C, D, characteristic emission from dif- ferent impurities separately selected — manganese, nickel and calcium respectively. or AgL characteristic radiation to form the picture. The distribution of the copper can thus be shown in one picture and the distribution of the silver in the other. Another way of displaying this same result is to regard the two pictures as components of a colour picture and photograph them through different filters in register on the same piece of colour film. In this way the copper was made to appear red and the silver green. In principle one can attach a given colour to a given x-ray wavelength, which may be a useful technique for presenting in one picture the relative positions of several elements. As an example of the identification of inclusions in a surface, fig. 4 shows some impurities in a piece of beryllium foil (3). In A all the emitted x-rays were used to form the picture and the impurities show up as emitting more strongly than the beryl- lium. In 5, C, and D the pulse analyser was set to pass the characteristic radiation from three different types of impurity in turn, which were identified as manganese, nickel and calcium respectively. The in- formation may again be presented on one picture in colour. The energy resolution of the proportional counter is not good enough for the separation of character- istic radiation from elements which differ by less than about four in atomic number. However, it seems that there would be sufficient intensity reflected from a curved crystal in the spectrometer to form the picture, in which case adjacent elements would easily be separable. The instrument, therefore, can show up either the topography of a surface by electron scattering with a resolution of well below I //, or the distribution of an element over a surface by x-ray emission with a resolution of about I //. A selected point in the surface can then be analysed quantitatively by plot- ting the characteristic x-ray emission spectrum by means of a crystal spectrometer. References 1. Castaing, R., Thesis. Paris, 1951. 2. Castaing, R. and Descamps, J., J. pliys. 16, 304 (1955). 3. COSSLETT, V. E. and Duncumb, P., Nature 177, 1172 (1956). 4. CossLETT, V. E. and Nixon, W. C, /. Appl. Pins. 24, 616 (1953). 5. McMuLLAN, D., Proc. Inst. Elec. Engrs., Pt. 1, 100, 245 (1953). 6. Nixon, W. C, Proc. Roy. Soc. A 232, 475 (1955). 7. Smith, K. C. A. and Oatley, C. W., Brit. J. Appl. Phys. 6, 391 (1955). Imaging Elements Operating with Permanent Magnets B. V. BoRRiES t, G. Langner and W. Scheffels Rheinisch-Westfdlisches Iiistitut fiir Vbermikroskopie, Diisseldorf Electron lenses operating with permanent magnets can be employed in electron microscopes, as several authors (I, 8) have shown. The advantage of such lenses is that no source for a highly stabilized lens current is needed. As the main disadvantage during operation must be named the impossibility to switch off the magnetic field. Moreover there must be at least two gaps in a system excited by permanent magnets to avoid stray field. This does not neces- sarily mean, however, that these gaps must act as separate lenses. Permanent magnetic einzel-lenses with variable focal length have been used as con- densor lenses by v. Borries (1954), the magnetic circuit of which has been calculated by v. Borries and Lenz (4) and the properties of which have been investigated experimentally by Langner (6). Also as Imaging Elemenls with Permanent Magnets 15 ^gS ^ ^m: Strahlnchtung 1, Permanent magnet. 2a, 2b, Disploceable polepieces of the intermediate lens. 3, Insert, at the same time fixed pole- piece at the final projector lens. 4, Disploceable polepiece of the fmal projector lens. 5, Control nut. 6, Bevel gear. Fig. 1. Cross section through a two-stage projective system operating with permanent magnets. an electron microscope objective lens a permanent magnetic einzel-lens may be used. On its electron optical properties Lenz (9) has published a paper. Such einzel-lenses and any lens system of two or more gaps operated by a single permanent magnet as described e.g. in a paper by v. Borries and Langner (4) show no image rotation, or, if the specimen im- merges in the field as is the case in strong lenses, the image rotation is at least small and does not vary noticeably when the magnification is changed. The size of such a system depends on the niagne- tomotoric force of the permanent magnet. The opti- mum shape of a permanent magnetic lens system has been calculated by v. Borries and Lenz (4), and it can roughly be said that for the diameter D of such a system, provided the best obtainable Alnico magnets with at least 4.5 10'' Gauss-Oersted are used, the following simple rule holds: Z) = 7 10 - mm Amp ' /, where / is the number of ampere-turns the magnet supplies when in the system. Based on the design of what we think an optimum system for an electron lens system with rotational symmetry three perma- nent magnetic electron microscopes have been com- pleted with / =i 2500 Amp on which papers have been published by v. Borries (1,2). Recently we have built a two-stage projector system of / = BOO^.. VergroOerung lC% P loy. 5% 10 75 — » ! mm ausgenulzler Bereich 20 Fig. 2. Magnification and distortion of a two-stage perma- nent magnetic projector system. 1720 Amp, PU = 60 Amp- Volt for 50 kV, for the use with an immersion objective. The cross section is shown in fig. I . The magnet is outside the vacuum. The intermediate lens is formed by the polepieces 2a and 2/?, the axial displacement of which permits the magnification of this stage to be varied. The properties of such lenses have been described earlier (6, 7). A rather large range of magnifica- tion is achieved at the cost of considerable radial distortion. The final projector has therefore been designed as a lens with a variable gap-w idth which yields less distortion but also less variation of magni- fication. Fig. 2 illustrates magnification and radial distortion versus the displacement of the polepieces. The magnification can be continuously varied in the ratio I :20 while the specimen is under observation. Furthermore we have enlarged the above-men- tioned system and used a magnet with 3250 Amp. With this two-stage microscope a magnification of 2 axial displacemcnl of an iron piece 2 the second gap opens. So the back focal plane of the first gap can he imaged to obtain tiiree-stage difiVaction diagrams. In the first gap we use a magnetic stigmator 3 which is schematically shown below. Two pieces of iron slide within slotted pieces, so the a/imuth and the streiigtli of the stigmator can be controlled separatel>. The projector consists of a polepiece unit 4 which is also axially displaceable and permits a variation of the magnification of 1:11. New in respect to for- mer instruments of that kind is the separate control of the magniticalion in the projector and in the objective. Owing to this it is e.g. possible to image 16 B. V. BORRIES t, G. LANGNER AND W. SCHEFFELS ijjjj' "S*. J / = 3250 Amp., (J = 60 kV. Continuous variation of magnifi- cation between the three stage diffraction patterns and Amax = 28 000. Fig. 3. Cross section of a permanent magnetic microscope system. three-Stage diffraction patterns with different magni- fications. It is also possible to use the whole system as a diffraction condensor, and also to use it as an elec- tron shadow microscope. If crystalline matter is put into the caustic, dynamic diffraction patterns can be obtained which resemble Kikuchi lines. Such patterns from MgO crystals are shown in fig. 4. Another problem in the field of permanent mag- netic lenses which we have investigated is the so-called "reflexion microscopy" which is really a dark field microscopy of surfaces hit by the electron beam in grazing incidence. In order to avoid immer- sion the focal length must be considerably greater than half the gap width in order to give space for the axial movement of the specimen. On the other hand the chromatic aberration constant C< should be as small as possible because the mostly inelastically scattered electrons which are used to image have suffered considerable energy losses AE. If we put for a moment C- «^/ (/- focal length), and d be the diameter of the aperture stop, we obtain for the resolving power d> / C eU* cU* Fig. 4. Kikuchi lines of MgO crystals obtained in the caustic of a strong permanent magnetic lens. when using permanent magnetic lenses with the rela- tivistic accelerating voltage U*. The image brightness goes with the 2nd power of a, so using half the focal length one should get four times the brightness in the image at the same resolution and magnification. The requirement of non-immersion objective lenses sets a limit to the lens excitation. We have tried an objective lens with h = 1 mm bore, .v = 0.8 mm gap-width,/ 1.45 mm, C = 1-35 mm which needs / - 1450 Amp at 60 kV. In a two-stage permanent magnetic system this demands the same low excita- tion also for the projector which then is likely to cause distortion. This is a difficulty which arises when using permanent magnetic microscopes for "reflexion microscopy". This difficulty can be over- come by using two-gap objective lenses, over which the effective ampere turns of the magnet are dis- tributed so that the objective lens gets a suitable low excitation and the series gap takes the rest and is used as an intermediate lens. The latter, however, may also cause some distortion. We leave now the permanent magnetic lens systems with rotational symmetric lenses, and turn to ele- ments with less symmetry. For "reflexion micros- copy" normally the condensor is tilted. It is also possible to deflect the beam so that its angle of in- cidence is suitable for "reflexion microscopy". K. Ito and T. Ito (5) have used deflection coils. We have tried to use small permanent magnets. For small deflection angles [i the following relation holds Magnetostatische Linsenanordnungen mil Dwchanischen Regelglicdern 17 Fig. 5. Reflection units using small permanent magnets. ^ = 2 mo U* BAz)dz. Here c is the charge of an electron, /?/„ its mass, Bx the component of the induction normal to the plane of motion. - measures in the initial direction, the field extends between, r„ and r,. Fig. 5d illustrates the principle of a deflection unit working with small flat AInico magnets. Fig. 5a shows the unit assembled and Fig. 5/) the magnets, the magnetic link and the moimt. With these magnets an angle of deflection of I 1 can be obtained. It may only be mentioned here that two permanent magnets of this type can be arranged in a way that they form a magnetic quadrupole and so have focus- sing properties. Lenses of both positive and negative focal length in the order of 5-6 mm could be realized with the small magnets described above. The very preliininary experiments were carried out with the help of a device shown in fig. 5c, which has two or four degrees of freedom. For many fruitful discussions the authors wish to thank Dr. Lenz. The technical designs of the lens systems lay in the hands of Ing. J. Huppertz. References 1. VON BORRIES, B., Kolloid-Z. 114, 164-167 (1949). 2. — Z. wiss. Mikioskop. 60, 317-358 (1952). 3. VON BoRRiES, B. and Lanuner, G., Comples rendus du colloque CNRS a Toulouse, 4.-8. April 1955, pp. 285-295 (1956). 4. VON BoRRiES, B. and Lenz, F., Optik 13, 264-276 (1956). 5. Ito, K., Ito,T. and Watanabe, M., /. Electron-microscopy (Japan) 2, 10-14 (1954). 6. Langner, G. Optik 12, 554-562 (1955). 7. Langner, G. and Lenz , F., Optik 11, 171-180 (1954). 8. Reisner, L H. and Dornfeld, E. G., /. Appl. Phys. 21, 1131-1139 (1950). 9. Lenz, F., Z. ong. Plus. 8, 492-496 (1956). Uber magnetostatische Linsenanordnungen mit mechanischen Reeeleliedern^ K. MiJLLER Siemens & Halske AG, Wernerwerk fiir Mefitechnik, Berlin-Siemensstadt IM Rahmen einer Entwicklung magnetostatischer Elektronenlinsen haben wir vor allem die Moglich- keiten studiert, die Brennweite solcher Linsen zu regein, wie es zur Scharfstellung des Bildes oder zum Wechsel des AbbildungsmaBstabes notwendig ist. Die Brennweite einer magnetischen Elektronen- linse hangt von drei GroBen ab: von der Strahlspan- nung, der Maximalfeldstiirke im Linsenspalt und von der Halbwertsbreite des Linsenfeldes. Die Anderung einer dieser drei GroBen bewirkt eine Regelung der Brennweite, doch sind nicht alle GroBen in gleicher Weise geeignet: Strahlspannungsiinderungen beein- flussen in meist unerwiinschter Weise das Durch- ^ Eine ausfiihrlichere Veroffentlichung crschcini dem- nachst in Z. wiss. Mikroskopie. 2 — 568204 Electron Microscopy dringungsvermogen der Elektronen. Man wird diese Moglichkeit der Brennweitenregelung deshalb hoch- stens in einem schmalen Bereich anwenden, der zur Feinfokussierung des Bildes geniigt, dagegen fur Grobscharfstellung und VergroBerungswechsel die Anderung von Maximalfeldstarke und Halbv\erts- breite vorziehen. Die Halbwertsbreite des Feldes ist — wenn man von Siittigungserscheinungen absieht — allein eine Funktion der Linsengeometrie. also des Polschuhabstandes und des Bohrungsdurchmes- sers. Sie kann daher durch das Auswechseln von Polschuhen oder durch Verschieben der beiden Pol- schuhe einer Linse gegeneinander veriindert werden. Das Auswechseln schien uns technisch unbequem:die Moglichkeit einer Polschuhverschiebung gefahrdet eine exakte Zentrierung der Linsen. Wir wahlten deshalb den dritten Weg: die Regelung der Feld- 18 K. MULLER ,5iJ: [\\\\\\\\\.\ As\';,'.^\'q ' Ps m I I Tn^ t^tv\vjjt^\v ^1 ^ t -^ 5^M ^ A\\V\\\\31 ^^ tssssszzztx: ^ Eis»nschluO Luftspalt wo^ \^ 50 H *^ Drrhwinkel — W 2^ 30° ~*d' SO' Abb. 1. Magnetostatische Linsenanordnung mit Zackenreg- ler. a) Magnetische Anordnung; b) elektrisches Ersatzbild: c) Zackenregler; d) Feldstiirke-Regelkurve. K^ 50 H E \ *°"^ 1 Regelweg i. 20 40 c 60 Abb. 2. Magnetostatische Linsenanordnung mit Innen- scheibe. a) Magnetische Anordnung; b) elektrisches Ersatz- bild; c) Feldstarke-Regelkurvc. Starke durch Anderung der magnetischen Spannung am Linsenspalt. B. v. Borries und Mitarbeiter er- reichen eine solche Anderung z. B. durch wechselnde Aufteilung einer konstanten Spannung auf zwei Linsenspalte (z. B. G. Langner 1955). Es gibt aber noch andere Moglichkeiten, das Linsenfeld bei starrer Polschuhanordnung durch die Bewegung von Eisenteilen zu beeinflussen: Abb. 1 zeigt eine magnetische Linsenanordnung, daneben das elektrische Ersatzschaltbild: Ein Per- manentmagnet moge zwei Linsenspahe (Z.i und L.) gegenpolig erregen. Dem Magneten entspricht eine Stromquelle mit dem inneren Widerstand R^. R^^ und /?i„ entsprechen den magnetischen Widerstan- den der Linsenspalte. Man kann die Spannung an Ri, nun z. B. durch Einfiigen eines Widerstandes R vermindern. Im magnetischen Kreis geschieht das am einfachsten durch einen Zackenregler (Abb. 1 c): Man verwendet zur FluBfLihrung zwischen Magnet und Linse ein Rad mit einer beliebigen Anzahl von Speichen, die so geteilt sind, daB das Rad in einen ruhenden Teil. den ,,Stator", und einen beweglichen Teil, den „Rotor", zerfallt. Bei Drehung des Rotors andert sich die GroBe der Beriihrungsflache zwischen Stator und Rotor und damit der magnetische Wider- stand zwischen Magnet und Linse. Infolgedessen andert sich die Feldkurve im Spalt der unteren Linse (Lo) gemaB der in Abb. 1 d dargestellten Kurve. Die etwas wechselnde Belastung des Magneten verur- sacht eine wechselnde Durchstromung des inneren Widerstandes /?;. Daher liiBt sich eine geringe RCick- wirkung des Regelvorganges auf die zweite Linse des Systems nicht vermeiden. Sie ist gegensinnig, d.h. bei Schwiichung der Linse 2 wird Linse 1 etwas st-irker. Abb. 2 zeigt einen anderen permanentmagneti- schen Kreis und sein elektrisches Ersatzschaltbild. Es sei diesmal eine Beeinflussung der oberen Linse (Li) erwiinscht. Dazu dient eine ringformige Regel- scheibe, die zwischen Magnet und Polschuhhalter axial beweglich ist und einen variablen Teil des Magneten zusatzlich belastet (Innenscheibe). Durch geeignete Dimensionierung kann man erreichen, daB beim Aufwartsbewegen der Scheibe der Weicheisen- kreis zwischen Magnet und Linsenspalt infolge der FluBerhohung in wachsendem MaBe gesattigt wird. Das entspricht einer Veranderung des Widerstandes Ri und bewirkt demzufolge eine Anderung der Feldstiirke in der oberen Linse. Auch diese Regelung erfolgt wegen der wechselnden Durchstromung des Widerstandes R^ mit geringer, diesmal gleichsinniger Rijckwirkung auf die zweite Linse des Systems. Gelegentlich legt man Wert darauf, daB beide Linsen in gleichem MaBe geregelt werden. Dazu eignet sich eine Ringscheibe zwischen dem Magneten und dem AuBenmantel des Systems (AuBenscheibe, Abb. 3). Bei dieser Anordnung ist die Anderung der Durchstromung von /?,, die bei einer Axialbewegung dieser Scheibe auftritt, keine Nebenerscheinung, sondern der bestimmende Regelvorgang. ^ ■.Aj/wvy X\ .\\\\\\yj\\ . '/A ES3' Abb. 3. Magnetostatische Linsenanordnung mit AuBen- scheibe. a) Magnetische Anordnung; b) elektrisches Ersatz- bild; c) Feldstiirke-Regelkurve. Magnet ostatische Linsenanordmmgen niif mechanischen Rcgelglicdern 19 100'/'- 80 60 40 20 4-5lufige 3-stufige ■( ' ^i\ Abbildung :^ \ 1 t x/ ^^^^~~ 6 8 Antnebsskala - 10 Skt Abb. 4. Magnetostatische Vierllnsenoptik (vereinfachle Dar- stellung). Wir haben nun eine Vierllnsenoptik zur elektro- Abb. 5. VcrgroBcrungseichkurvc fiir magnetostatische Vier- linsenoptik mit Zackcnrcglcr. und einen Zackenregler gespcist. Bei gcschlossenem Regler erhielten die Mittellinscn die voile Magnct- spannung von etwa 2000 AW und waren so kurz- brennweitig, daB z.wischen ihnen ein recllcs Bild nenoptischen Erprobung der verschiedenen Regel- entstand. Durch OfTncn dcs Rcglers konntc die verfahren gebaut. Abb. 4 zeigt eine — der Uber- sichtlichkeit halber stark vereinfachte — Schnitt- zeichnung dieser Optik: Die beiden iiuBeren Linsen, Objektiv und Projektiv, wurden mit je einem axial angeordneten Rohrmagneten aus Alnico 400 aus- gestattet. Die Systeme wurden so magnetisiert, daB gleichnamige Magnetpole einander gegeniiberstan- den. Die Mittellinsen wurden uber den AuBenmantel magnetische Spannung an den Mittellinsen stetig auf die Hiilfte des ursprunglichen Wcrtes vermindert werden. Die Brennweitcn der Linsen wurden dadurch so vergroBert, daB aus den zwci Ein/cllinsen ein Dublett entstand. Der Zackenregler ermoglichte auf diese Weise eine wirksame Anderung des Abbil- dungsmaBstabes. Eine Eichung desZackenregleran- triebes gab eine schnelle und fiir die meisten Zwecke Abb. 6. Doppelaufnahme desselben Objektfeldes ciner Platin-Aufdampfschicht mit der magnetostatischen Vierlinsen- optik. Elektronischer MaBstab 28000:1. Wicdergabe 240000:1. Strahlspannung 60 kV. Aiifnalimcmalcrial: Pe- rutz-Kontrastplatte. Belichtungszeil 4 sec. 20 S. LEISEGANG UND O. SCHOTT ausreichend genaue Angabe des jeweiligen Abbil- dungsmaBstabes. Abb. 5 zeigt eine derartige Eich- kurve, links das Gebiet vierstufiger Abbildung, rechts das Gebiet dreistufiger Abbildung mit Dublettwir- kung der Mittellinsen. Wir dimension ierten die Linsen so, daB sich ein maximaler AbbildungsmaBstab von 60000:1 ergab. Im Gebiet vierstufiger Abbildung Hess sich die VergroBerung auf weniger als jq herabregeln, ohne daB die Verzeichnung des Endbildes in radialer oder tangentialer Richtung groBer als 6 "„ wurde. Durch den Ubergang zu dreistufiger Abbildung lieB sich der ausnutzbare Regelbereich noch erweitern. Es stellte sich niimlich heraus, daB dreistufig erzeugte (jbersichtsbilder wesentlich weniger verzeichnet wa- ren als ebenso schwach vergroBerte vierstufige Abbil- dungen. Bei diesem groBen Regelumfang war es besonders angenehm, daB diese Regelart keine Bild- drehung verursachte und es durch gute Zentrierung von Linsen, Zackenregler und Elektronenstrahl ge- lang, die Lage des Bildmittelpunktes wahrend des Regelvorganges praktisch unbeweglich in der End- bildschirmmitte zu halten. Die mit der Anderung der Mittellinsenerregung verbundene Defokussierung des Bildes muBte durch andere Regelorgane kompensiert werden. Wir hatten dafur urspriinglich eine Innenscheibe im Objektiv- kreis vorgesehen. Es stellte sich aber heraus, daB der Regelbereich der Scheibe dieser Aufgabe nicht anniihernd entsprach. AuBerdem war ihre Axialbe- wegung infolge des unvermeidbaren mechanischen Spiels mit geringen Querbewegungen verbunden. Die dadurch verursachten Verschiebungen des Bildes storten die Beobachtung gerade bei der Scharfstel- lung. Ein derartiger EinfluB der Scheibenbewegung auf den Elektronenstrahl nimmt ab, wenn die Ent- fernung zwischen Regelkorper und Strahl wiichst. Nun enthielt die Anordnung auBer dieser Innen- scheibe noch zwei weitere Regelscheiben, die sich zwischen den beiden Magneten und dem Mantel des Systems befanden. Diese AuBenscheiben waren vorziiglich geeignet. eine Grobscharfstellung des Bildes vorzunehmen. Die Feinfokussierung mit mechanischen Regelgliedern erwies sich als unbe- quem, weil bei der Hin- und Riickbewegung infolge der Hysterese des magnetischen Materials etwas verschiedene Regelkurven durchlaufen werden. Sehr viel angenehmer ist statt dessen eine Feinregelung der Strahlspannung. Der notwendige Regelumfang von ± 500 V hat nicht den oben erwahnten Nachteil, daB die Durchdringungsfahigkeit der Elektronen merklich geiindert wird. Es ist noch zu erwiihnen, daB es durch gleichzeitige Betatigung von Zackenregler und AuBenscheiben gelang, Beugungsdiagramme durch die nicht ab- schaltbaren Linsen zu fiideln. Allerdings muBte der Objektbereich dabei auf weniger als 30 /.i c begrenzt werden. Wir wollten die besprochene Anordnung gleich- zeitig benutzen, um zu demonstrieren, daB sich auch mit derartig geregelten magnetostatischen Linsen ein recht gutes Auilosungsvermogen erreichen liiBt. Wir legten deshalb groBen Wert auf gute Zentrierung von Linsen und Elektronenstrahl. Bei der schritt- weisen Entwicklung der optischen Eigenschaften war auBerdem der Einbau eines Stigmators besonders wirkungsvoll. Wir erreichten bisher ein Auilosungs- vermogen von 2 m/< (Abb. 6). Diese Grenze wird durch den Farbfehler bestimmt und ist wahrschein- lich auf die objektbedingte Streuung der Elektronen- energien zuriickzufi-ihren. LiTERATUR Langner, G., Optik 12, 554-562 (1955). Der EinfluB der Bestrahlungsbedingungen auf die Objektverschmutzung S. Leisegang und O. Schott Siemens und Halske AG, Wernerwerk fiir Mefitechnik, Berlin-Sicmensstadt Die Objektverschmutzung ist bei der Mikroskopie hochster Auflosung eine sehr storende Erscheinung. Nach den Messungen von Ennos ist die Verschmut- zung stark abhangigvonderTemperaturdesObjektes. Durch verschiedene Bestrahlungsbedingungen kann die Temperatur des Objektes bei gleicher Stromdichte in weiten Grenzen verandert werden. Das hat zur Folge, daB auch die Objektverschmutzung stark von den Bestrahlungsbedingungen abhiingt. Diese Ab- hiingigkeit wird theoretisch und experimentell unter- sucht. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Tat- sache, daB bei Bestrahlung der Objektblende selbst eine ganz wesentliche Erhohung der Temperatur des Objektes eintritt. Die Objektverschmutzung wurde in einem El- miskop I als Funktion der Stromdichte bei Zim- mertemperatur (etwa 25 C) auf folgende Weise gemessen: Mit Hilfe des Feinstrahlkondensors wird ein klei- ner Bereich des Testobjektes von 2 /< bestrahlt. Durch Bestrahlung eines so kleinen Bereiches wird die Temperatur des Testobjektes auch bei hoher Stromdichte nicht merklich erhoht [4]. Die Bestrah- lungsstromdichte wird bei bekannter VergroBerung im Endbild mit Faradaykiifig und Elektrometer gemessen. Die Objektdicke d und die Dicke der aufgewachsenen Verschmutzungsschicht c/,, wird durch Messung der Streuabsorption (Objektivaper- Bestrahliingshi'dingungen imd Objektverschmutzung 21 10 A/sek I f \ oos 0,1 015 A/cm^ dZ Bild 1. Objektverschmutzung V als Funktion der Strom dichte j bei Zimmertemperutur. turblende 5Q i-i , Objektivapertur a„ - 9- 10-=*) nach den in [5] angegebenen Formeln bestimmt. Die Mes- sung erfolgt auch hier mit Faradaykiilig und Elek- trometer im Endbild. MeBgroBen sind die im Fara- daykafig durch die unverschmutzte Folie gemessene Stromdichte y und die durch die verschmutzteZone ins Endbild gektngende Stromdichte /,.. Die Dicke der aufgewachsenen Verschmutzungsschicht d^ er- gibt sich dann aus: Jv — =exp i-dyiXe). J (1) Fiir /.^., die mittlere freie WegUinge fijr elastischen StoB, wurde bei 80 kV Strahlspannung der Wert Ap 2000 A eingesetzt. Als Testobjekte wurden etwa 300 A dicke Kohlefolien verwendet. Das Ergebnis dieser Messungen ist in Bild 1 dargestellt. Der in Bild 1 wiedergegebene Verlauf der Objekt- verschmutzung als Funktion der Stromdichte legt eine statistische Deutung der Erscheinung nahe. Die die Verschmutzung erzeugenden Molekiile mogen einen Radius R, ein Molekulargewicht M, einen Partialdruck p und eine durch Adhasion be- dingte Verweilzeit auf der Folie t haben. Die Wahr- scheiniichkeit ^V, daB eines der die Verschmutzung erzeugenden Molekiile bei gegebener Elektronen- zahl // cm- sec getroffen wird. ist gegeben durch W^TiR-TH R'nr- ^ e (2) 7 ^ Stromdichte (A cm-), e -- Elektronenladung (Coul). Die Wahrscheinlichkeit W wird gleich 1 I'iir die Stromdichte y„, die gegeben ist durch 70 = jiR^r (3) Fiir die Objektverschmutzung f^(7)ergibt sich daraus die — die MeBergebnisse gut wiedcrgcbendc — Beziehung J/(i) = J/(oo)[l -exp(-/7o)]. Eine weitere Betrachtung erlaubt. aus Annahmen liber den Molekiilradius die Verweilzeit t und den Partialdruck p der die Verschmutzung erzeugenden Diimple ab/uschiitzen. Aus der kinctischcn Gastheoric [2] folgt zuniichst bei gcgebencm Partialdruck /; die Zahl der StoBe gegen die Folie ( Wand) pro Sekunde und Quadrat- zentimeter A: /4 = 3,5 • 10" °K^- mm Ug"' cm"- sec"' 1 MT (4) Die Verweilzeit der Molekule auf der Folic bei rein elastischem StoB t„ sei dadurch dcfiniert, daB ange- nommen wird: Verschmutzung erzeugende Mole- kiile sollen dann noch von den Elektronen auf der Folic „festgenagelt*' werden, wenn sie beim Zusam- menstoB nicht ueitor als eine Strecke A.v von der Folie entfernt sind. Ausdcr mittlercnGeschwindigkeit r - 14,5- lO'cm -1 l^-'/o \j/]^ (jer Molekule folgt damil fiir cm sec" Ax/z;. (5) Die Zahl der Molekiile /?, die sich pro Sekunde und Quadratzentimeter bei einer Verweilzeit t > t„ auf der Folie belinden, ist dann gegeben durch n (6) Die Objektverschmutzung F(oo), bei der die Strom- dichte der Elektronen so groB ist, daB allc Molekiile festgenagelt werden, ergibt sich aus der einfachen Annahme, daB die Zahl der Molekiile fiir eine cin- molekulare Schicht der Fliicheneinheit /?i gegeben sei durch (7) K'n zu F(cxd) 1R = n. >3 T n R 71 • 10-"' • mm Hg^' cm ' sec^" ^ -- • (8) Zwischen M, R und Dichte q gelte die oft gebrauchte Beziehung [2] R 0.66-1 (9) Damit fiillt aus (8) R und M heraus und mit n ^ 1 g cm'' (schwcres Ol) gilt F(oo),. 10^ cm- sec " mm Hg -1 -^P A.v (10) Fiiry,, und r( • ) crgebcn sich aus Bild I die Werte /o= 0,014 A cm- und Vi ^ ) 8 A sec. Als Ver- schmutzung erzeugende Molekule seien hochmolc- kulare KohlcnwasserstotTc mit A/ ^ 300 und damit nach Gl. (9) R ^ 4,5 A angenommen. 77 S. LEISEGANG UND O. SCHOTT Dann folgt aus Gl. (3) fijr die Verweilzeit t ^ 2- 10"^ sec und mit der groBenordnungsmaBig sicher richtigen Annahme A.y =t 1 A fiir den Partialdruck p ^ 5- \0~^'^ mm Hg. Die Verweilzeit ist also relativ sehr groB, der Partialdruck der die Verschmutzung erzeugenden Diimpfe auBerordentlich klein. Als unsichere Faktoren enthalt Gl. (3) den Wert von R, ein um den Faktor 4 kleineren Radius, der als minimaler Wert gelten kann, fiihrt zu einem um den Faktor 16 groBeren Wert fiir t und damit nach Gl. (10) zu einem um den Faktor 16 kleineren Wert von p. AuBerdem ist p noch proportional zum nur groBenordnungsmaBig bekannten Abstand A.y. Die Objektverschmutzung als Funktion der Tem- peratur wurde von Ennos [3] bei einer Stromdichte von 0,01 A cm- im Bereich von 50 bis 200 C ge- messen. In diesem Bereich lassen sich die Messungen wie- dergeben durch die Beziehung: ViT) = F„exp(-r/r„), T = Temperatur CK), r„ =- const =^ 84°K. (11) Es sei angenommen, daB diese Beziehung im ganzen interessierenden Bereich 300 'K < T < lOOO'K gelte. Die wesentlich temperaturabhangige GroBe in Gl. (3) und (10) ist die Verweilzeit r. Die Objektver- schmutzung als Funktion von Stromdichte und Tem- peratur V{j, r)sollte sich dann darstellen lassen als: t{T) - exp - 7 y T(T) Jo '^z (12) Tz, ^z = Werte von T und t beiZimmertemperatur. FiJry = 0,01 A cm- soil die von Ennos gemessene Beziehung (11) gelten. Bild 2. Objektverschmutzung Tals Funktion von Stromdichte j und Temperatur 7" (nach Formel (12)). + + = Temperaturabhangigkeit bei J -= 0,01 A cm- nach Ennos. O O = Stromdichteabhangigkeit bei T 300°K nach Bild 1. Mit diesen Annahmen kann die Funktion r (T) und damit aus Gleichung (12) die Verschmutzung als Funktion von Stromdichte J und Temperatur T, V (j, T) berechnet werden. Die Ableitung der Formeln ist in Anhang I gege- ben, das Ergebnis der Rechnung zeigt Bild 2. Die Temperaturverteilung auf einer Folic glei- cher Dicke wurde in einer friiheren Arbeit als Funktion der Stromdichte und des bestrahlten Be- reiches berechnet [4]. Bei dieser Rechnung wurde vorausgesetzt, daB sich die Objektblende oder das Kupfernetz, von dem die Objektfolie getragen wird, auf Zimmertemperatur befindet. Diese Bedingung ist nicht immer erfullt. Wird auBer der Objektfolie auch ein groBer Teil des Objekttragers bestrahlt, so kann die Temperatur des Objekttragers wesentlich hoher sein als die Temperatur, die sich bei gleicher Stromdichte bei Bestrahlung der Objektfolie allein ergibt. Auch die Erwarmung der Objekttrager liiBt sich aus den in [4] angegebenen Formeln in einfacher Weise berechnen. Da die Warmeabstrahlung bei den relativ dicken Objekttragern (Dicke etwa 50 //) praktisch keine Rolle spielt, wird die Temperatur proportional zur Stromdichte j. AuBerdem geht die geometrische Gestalt der Objektblende ein: Die Dicke d und der Radius R des inneren Bereichs der Blende mit der Dicke d spielen dabei — neben den Materialkonstanten — die wesentliche Rolle. Die Reichweite der Elektronen ist kleiner als die Dicke der Objekttrager: praktisch die gesamte kinetische Energie der Elektronen wird in Warme umgesetzt. Der Blendenrand, dessen Dicke (etwa 1 mm) sehr groB gegeniiber der Dicke d des inneren Bereiches ist, sei als so gut wiirmeleitend angenommen, daB dort Zimmertemperatur erzwungen wird. Auf die Einzelheiten der Rechnung sei hier nicht naher eingegangen, die Formeln sind in Anhang II zusam- mengestellt. Die Temperatur einer Objektblende bei einer M °C furj-0fllk\m^ _^ \ ' "■ / ^ / / / 100 / / / / ?\-Blen(Je: > Cu-Netz : > ■ = 50\i.; R= 0,3mm i~2S\i: /?= / mm / A / n ^ k 0^1 furP\-B lende ¥ mm 0^ 0,1 WrCn-Nefz 0,5 mm 1 'b- Bild 3. Erwarmung \t einer Objektblende aus Platin der in Bild 5 dargestellten Form oder eines Kupfernetzes von 25 (x Dicke, das mit einem Kiipferring vom Durchmesser 2 R = 2 mm gehalten ist. als Funktion des Radius des bestrahlten Bereiches rs bei einer Stromdichte j = 0,01 A cm^. Die Erwarmung ist proportional zur Stromdichte j (siehe Glei- chung 11,4). Bestrahhrngsbedingungen und Ohjck t vcrschnwtziing 23 Stromdichte von / 0,01 A cm- ist in Bild 3 darge- stellt. Als geometrische Daten sind die Wcrte ciner oft verwendeten Objektblende {d = 50 //, R 300 //, Material Platin, siehe Bild 5) in die Rechnung cin- gesetzt. Die Temperatur wird Funktion vom Radius des bestrahlten Bereiches 1-^. Zwischen Stromdichte y, Radius des bestrahlten Bereiches r^ und Strahl- stromstiirke / besteht die Beziehung: r^-rrv = /• (13) Danach erreicht die Temperatur der Objektblende • — die Temperatur ist in erstcr Niiherung proportio- nal zur Stromdichte — bei Bestrahlung eines Be- reiches von 600 fi bei einer Strahlstromstarke von 28 /rB die Stromdichte y = ist. Tat- siichlich hat die Stromdichte als Funktion von r eine GauB- verteilung j (r) =Jq exp — {rJrB)'-. Die aus Gl. (11,1 ) berechnete Temperatur wird, solange /-s^ Blendenradius ist, merklich groBer als die gemessene Temperatur. Bestrahlungshedingiingen unci Ohjck I vcrschmiitzung 25 Anhang IV wiedergegeben, das Ergebnis in Bild 7 als gestrichelte Kurve eingezeichnct. Die Uberein- stimmung beider Kurven ist fiir //, > 0,4 A cm- recht gut, die Abweichungen fiir y^ < 0,4 A cm- werden in Anhang IV diskutiert. ANHANG T Berechnung der Funk t ion t(T) Annahmen: Fiir V(j\T) gelte die Glcichung (12). Fiir J 0,01 A cm- gelte die Beziehung von Ennos (Gleichung II). Dann folgt fiir die Verschmutzung als Funktion der Temperatur bei einer Stromdichte von 0,01 A cm-: 1/(0,01, T)=V(c^, r^)""^^^ Tz / 0,01 r(T)\ (1,1) Aus dieser Gleichung ist t{T) zu bestimmen. Es ergeben sich einfache Losungen fiir den Fall, daB (0,01 y„) [t{T) t^] sehr groB oder sehr klein gegen eins ist. Es gilt in diesen beiden Fallen: T{T)=r, fur 0,7 >!, F(co, Tz) Tz t( f F(oo, Tz) (1,2) fur 0,7 <1, Als einfache Losung fiir t( T) sei eine Summe dieser beiden Grenzlosungen angenommen: T(r)=Tz K(co, Tz) 0,7 • V<, K(oo, Tz) exp (TjlTf^) (1,3) Aus der Bedingung, daB fiir T = Tz^ 300'K die Verweilzeit t r^ sein soil, kann K„ bestimmt wer- den. Es gilt dann fiir t:{T) die Beziehung: r{T) = 6,2- 10-3 exp (~ 0,12 ^^ •[1 + 1,55 exp (0,006 7)]. (1,4) Durch Einsetzen dieser Werte fur t(D in Gleichung (12) ergibt sich die gesuchte Beziehung fiir V{j, T). Das Ergebnis der Rechnung zeigt Bild 2. ANHANG II Berechnung der Temperatur der Ohjek I blende Fiir die Temperatur auf einer diinnen Scheibe gilt die von v. Borries und G laser [1] aufgestelltc Diffc- rentialgleichung: d^'rio) ^driq) y do'' o do ^ (THQ)-f*) = 0. (11,1) Dabei bedeuten e=o = r Entfernung vom Mittelpunkt der Blende r(o) f' R Radius, bei dem Zimmertemperatur erzwungen wird T(o) Folientemperatur als Funktion von o Zimmertemperatur T' '0 1 + 0,12Qt-J CTt mit Q , der in der Folic in Wiirmc umgcsetzte Teil des Energievcrlustcs eines Elektrons (V), bei dickcn Folien glcich der Beschleuni- gungsspannung der Elektronen j = Stromdichte im Objekt (A cm'-) C = Strahlungskonstante (cal cm- sec grad') y- SCR^Tt x = Foliendicke (cm), / - Wiirmeleitzahl des Objektes (cal/cm sec grad). In [4] werden zwei Naherungslosungen fiir Glei- chung (11,1) angegeben. Der Geltungsbereich der Losungen ist dadurch gegeben, daB y/4 entweder sehr klein oder sehr groB gegen 1 (f - l)/f * ist. Fiir y/4 = I (f- l)/f* haben beide Losungen das gleiche Ergebnis, das fiir 78 nicht mehr als 10 "„ vom wahren Wert abweicht. Fiir den hier interessicren- den Fall relativ dicker Blenden (xsi^5-10~' cm) mit guter Warmeleitzahl ist die Bedingung y/4 < Kf-l)/f* allgemein erfiillt und y4 I (f - 1) f^ erfiillt, so daB nach [4] fiir die Temperatur auf der Folie die Naherung gilt, bei der die Warmeleitung in erster Naherung, die Warme- abstrahlung voll beriicksichtigt ist. Bei Bestrahlung der ganzen Folie mit gleicher Stromdichtegiltdanach fiir t(o^) die Beziehung: T(C'f) =T + Ci Jo (.h'T-Qp). (1TT,1) Der relative Radius Op der Folie ist hier gegeben durch das Verhiiltnis von /• zum Radius der Blen- denbohrung = Radius der freitragenden Folie Rp, so daB gilt: op = r Rp. Fiir Qp = 1 Oder r = Rp soil t (1) = t^ sein. Daraus folgt aus (111,1) C^- (111,2) und fiir die Temperatur in der Folienmitte, t(0): T(0)=f + Tb (111,3) ^(/yf5) Nach dieser Formel wurden die Kurven der Bilder 4 und 5 berechnet. ANHANG IV Daten zur Berechmmg der Temperatur einer Kohlefolie Die Kohlefolie liegt auf einer Platinblende der in Bild 5 gezeigten Form. Fiir die Erwiirmung der Platinblende gelten die Tabelle 1 angegebenen Daten. Fiir die Kohlefolie wurden folgende Daten einge- setzt: e=2g/cm3 0r = 8,5eV ^=3-10-^ x = 6-10-«cm /? =3.5 •10-'' cm C \-\Q-'-' Daraus folgt: f'= 1+0,2^:7; r" o 8,6-10-' (IV,1) Zur Berechnung der GroBe des bestrahlten Bereiches wird die Gl. (1) benutzt. Die Blendenbohrung wird dadurch beriicksichtigt, daB ein Nutzeffekt H einge- fiihrt wird. Dieser Nutzeffekt ist definiert durch die relative Zahl der Elektronen, die die massive Blende treffen. R H=\- j [exp - (rirBf]rdr. (IV,2) An Stelle von J rB~ wird HjrB~ in Gl. (11,3) eingesetzt und daraus ts bzw. t^ berechnet. Aus Gl. (111,3) folgt dann die Temperatur in der Mitte der Folie. Die Rechnung wird fiir /,, = 40 //A durchgefiihrt. Die folgende Tabelle 2 zeigt den EinfluB der verschiede- nen Faktoren auf die Temperatur in der Mitte der Folie. Tabelle 2. Berechnung der Temperatur einer 600 A dicken Kohlefolie auf einer Platinblende mit 70 fi Blendenbohrung und einem Bereich von 600 /< Durch- messer mit der Dicke 50 // bei 40 ftA Strahlstrom. /B = Temperatur am inneren Rand der Platinblende /q = Temperatur der Folie fiir tB = 30"C /f = Temperatur in der Mitte der Folie nach Gl. (111,3) j rB H IB ^0 tF A/cm- /' O' /O °c °C °C 0,01 350 100 200 36 190 0,1 113 91 750 84 655 0,3 65 75 760 205 660 1 36,5 38 610 420 680 1,5 30 25 530 520 750 In Bild 7 ist das Endergebnis der Rechnung dar- gestellt. Die Abweichungen fiir kleines J (groBe r^) sind verstandlich durch die in die Rechnung nicht voll eingehende GauBverteilung (siehe Anmerkung Seite 24) und durch die wegen der Blendenform (siehe Bild 5) nicht voll erfiillte Forderung tg = tz fiir r = 300 ft. Die recht gute iJbereinstimmung der Kurven fiir y > 0,4 A cm- zeigt noch einmal, welch groBen EinfluB die Temperatur der Platinblende selbst auf die Objekttemperatur und damit auf die Objektver- schmutzung hat. Ohjektkiihlung im Elektronenmikroskop 11 LiTERATUR 1. VON BoRRits, B. iind Glasfr, \V., K'olloicl-Z. 106, 123 (1944). 2. DiJSHMAN, S., Scientific Foundations of Vacuum Tech- nique. New York, 1949. 3. Ennos, a. E., Brit. J. Appl. Pliys. 5, 27 (1954). 4. Leisegang, S.,Zur Erwiirmungelektroncnmikroskopischer Objektc bei kleinem Strahlquerschniti. I'roc. Int. Conf. El. Microscopy. London. 1954. 5. — Elektronenmikroskope. //;: Handbuch der Physik 33. Springer, 1956. Objektkuhlung im Elektronenmikroskop O. ScHOTT und S. Leisegang Siemens & Halske AG., Wenierwerk fiir Mefitechnik, Berlin-Siememstadt Versuche von S. Leisegang (1) mit einer gekiihlten Objektpatrone zeigten, daBsich dieObjektverschmut- zung vermeiden laBt, wenn der Dampfdruck der restlichen Kohlenswasserstoffe im Vakuum des Mi- kroskops in unmittelbarer Umgebung des Objektes durch Ausfrieren bei Temperaturen um 80 C stark vermindert wird. Es wurde eine Objektkuhlungsein- richtung gebaut mit dem Ziel, die verschmutzungs- freie Beobachtung der Objekte im Elektronenmikro- skop zu erreichen, ohne dabei die Leistungsfahigkeit des Gerates zu vermindern, wie das etwa durch eine thermisch oder mechanisch bedingte Objektwande- rung geschehen konnte. Uber den Aufbau der Ob- jektkuhlungseinrichtung und einige damit erzielte Ergebnisse soil hier berichtet werden. Die kiihlbare Objektpatrone ist in Bild 1 darge- stellt. In dem normalen Patronenkonus sitzt ther- misch isoliert ein Kupferzylinder, der beiderseits durch Blenden gegen den ubrigen Mikroskopraum abgeschlossen wird. Die untere Blende aus Platin- Iridium von 4 mm O mit einer Bohrung von 150 fx sitzt im Polschuh und befindet sich auf Zimmer- temperatur, wiihrend das gekiihlte Objekthiitchen in einem Abstand von 0,2 mm bis 0,4 mm iiber der Blende bewegt werden kann. Das Hiitchen hat eine Bohrung von 1 mm ;3 , so daB ein ausreichendes Gesichtsfeld vorhanden ist. Durch die Blenden- anordnung ist die Wahrscheinlichkeit des Ein- r^ Eisen Bronze TrolituI Kupfer (gekiJhlt) Konstantan zum Thermoelement Polschuh Objektblende 70 p.

. 631 und 27, 7.3 (1936). 2. Degenhard, W. und Mollenstedt, G., Optik 14 (im Druck). 3. Mollenstedt, G., Optik 12, 44! (1955). 4. Panzer, S., Optik 7, 290 (1950). 5. — ihicl. 10, 107 (1953). 6. Rang, O. und Weitsch, W., Optik 13, 201 (1956). 7. Steigerwald, K. H., Optik 5, 469 (1949). Bolzenkathode als Objekt im Elektronen-Emissionsmikroskop E. B. Bas Institiit fiir techuischc Physik, Eidgcnossische Tcclinischc Hoclisclmle. Ziirich In fruheren Arbeiten [1-4] wurde die vom Verfasser entwickelte Bolzenkathode im Zusammenhang ihrer Anwendung in Elektronenkanonen niiher behandelt. In folgender Arbeit soil gezeigt werden, daB diese Kathodenkonstruktion auch im Elektronen-Emis- sionsmikroskop als Objekt gute Dienste leisten kann. Anhand von Fig. 1 wollen wir zuerst das Prinzip der Bolzenkathode mit einigen Worten kurz cr- lautern. Das als Bolzen bezeichnetc Wolfram-Stiib- chen 1 ist an einem Ende in einer Klemmbacke 2 fest eingeklemmt, wahrend die Stirnfliiche am ande- ren Ende als Emissionsfliiche dient und in unserem Falle den zu untersuchenden StofT 3 enthiiit. Um den Bolzen herum ist konzentrisch eine Wolfram- Wendel 4 angeordnet, welche von den Stromzufiih- rungsstiften 5 und 6 getragen wird. Diese Zufiih- rungsstiftc tragen zugleich einen Strahlungsschutz, bestehend aus zvvei konzentrisch /um Bol/en ange- ordneten Molybdiin-Zylindern 7. Kathodenblende 8 vervollstiindigt die Kathode, wahrend V die erste und die zweite Blende des Immersionsobjektives darstellt. Die Heizung des Bolzens erfolgl so. daB die Wendel durch Stromdurchgang geheizt wird und als Primarkathode dient. Sie erhalt gegeniiber dem Bol- zen eine negative Spannung von einigen hundert Volt, womit die von der Wendel emittierten Elektro- nen auf den Bolzen aufprallen und ihn auf die ge- 38 E. B. BAS Fig. 1. Schnitt durch die Bolzenkatliode als Objekt im Emis- sionsmiicroskop. wiinschte Temperatur aufheizen. In der Heizschal- tung ist dafur Sorge zu tragen, daB infolge des Ruckheizeflfektes vom Bolzen auf die Wendel keine Heizinstabilitat auftritt. Bei niedrigeren Objekttem- peraturen kann die Bombardierung vollig aus- bleiben. Die Heizung des Bolzens erfolgt dann durch die Zustrahlung der Heizwendel. Fur die Anwendung der Bolzenkathode als Objekt im Emissionsmikroskop sind vor allem drei Dinge von Bedeutung: Axiale Ausdehnung des Bolzens, Schwingungen des Bolzens und das magnetische Storfeld der Heizwendel. Die axiale Ausdehnung des Bolzens ist nicht zu vermeiden. Die Emissionsflache der Bolzen- kathode bei der in Fig. 1 dargestellten Konstruk- tion verschiebt sich beim Aufheizen auf 2000"K Objekttemperatur um ca. 0,1 mm und bei lOOO'K betragt die Verschiebung ca. 0,04 mm. Die Ver- schiebung des Objektes bei konstanter Objekttem- peratur infolge Nichterreichen des Beharrungszu- standes ist meistens so gering, daB Belichtungen bis zur 30 sec. Belichtungszeit nicht dadurch gestort werden. Den mechanischen Schwingungen des Bolzens ist groBe Bedeutung beizumessen, da sie die erzielbare Auflosung stark beeinflussen konnen. Um hier einen Uberblick zu bekommen, betrachten wir den idea- lisierten Fall eines einseitig eingespannten elasti- schen Stabes von der Lange / mit einem Massen- punkt m am Ende (Fig. 2). Die Transversal-Koordi- nate dieses Massenpunktes bezeichnen wir mit y* und die laufenden Koordinaten des Stabes mit x, V. Dann laBt sich die Schwingungsgleichung dieses Systems wie in Fig. 2 formulieren. | ist der soge- nannte normale Viskositatskoeffizient [5], / equa- torielles Tragheitsmoment und E der Elastizitiits- modul. Fur die Anwendung dieser Betrachtungen auf die Bolzenkathode wollen wir folgende Vereinbarung treflfen: als die Stablange / soil derjenige Abschnitt gelten, welcher sich nicht auf hoher Temperatur befindet und dadurch seine Elastizitat bewahrt. Als Masse in gilt die Masse des iibrig bleibenden End- stiickes des Bolzens. Nehmen wir als Beispiel fiir G ii m d"-y* d'^y ,d Id" y dr dx dt \dx y =yo ^ 6xp 1 a o . COnt] COS O) t IE ml" /o = 2-ln2 ^ E \^ Fig. 2. Mechanische Schwingungen des Bolzens. unsere in Fig. 1 dargestellte Konstruktion mit: 1 = 1 10-1 cm, Jfi = 6 1 0-- cm, Ib-1 = 6 10-^ cm, m = 3,27 -< lO"'^ g, und fur Wolfram E^ 3,5 x 10'- Dyn/cm'^ | * 10* Dyn- sec/cm-, so erhalten wir: ojo ^23 kHz, /„ ^ 10-* sec. Nehmen wir weiterhin an, dass der Bolzen durch einen StoB auf eine Amplitude von: jo = 10-- cm angeregt wurde, so wird diese Amplitude in 1 m-sec. auf 10^- 10-^ = 10-5 cm oder 0,1 /< absinken. Wir sehen hieraus, daB die Erschutterungsempfindlich- keit bis herab zu der Auflosungsgrenze des Emis- sionsmikroskopes ausreichen diirfte. Die dritte uns hier interessierende Frage betriflft das magnetische Storfeld im Immersionsobjektiv, hervorgerufen durch den Wendel-Heizstrom. Dieses Storfeld kann man in zwei Anteile zerlegen; rota- tionssymetrischer Anteil hervorgerufen durch die Windungen der Wendel und Querfeldanteil, her- vorgerufen durch die Wendelzuleitungen. Die rotationssymmetrische Komponente ist sofort aus der Feldstiirkengleichung einer Zylinderspule anzugeben: m 'w W 11 w 1 1 + i-W /w + 2z 1 + «w /w-2z A/cm (6) Hier bedeutet: /„, = Wendelheizstrom W = Anzahl der Wendelwindungen 1^ = Wendelliinge d^jj = mittlerer Wendeldurchmesser z = laufende Koordinate auf der Achse der Wen- del von der Mitte der Wendel gezahlt. In unserer Anordnung hat die Heizwendel folgende Daten: /jv = 3,5 mm d^fj -= 1,35 mm W - 14 l^ ^^ 2 A. Bolzenkatbode als Ohjekt ini Elektronen-Emissionsmikroskop 39 12 10 Jw- 2A "w = J,5mm w ■ = M If, = < mm — 1 1 1 1 1 1 1 1 I 2 3 A 5 6 7 8 Ztinmm Fig. 3. Axialsymmctrische und transversale Antcile der magnetischen Storteldstiirke der Heizwendel. Damit erhalten wir fiir die axiale Feldstarke die Beziehung: H, ^ 50 1 i^^{^:i j/-t-S) Oersted (7) (r in mm). Diese Beziehung ist in Fig. 3 graphisch dargestellt. Die Querkomponente des magnetischen Wendel- Storfeldes, hervorgerufen durch die Wendel-Zulei- tungen, rechnen wir aus einem vereinfachten Strom- kreis. Nach dem Biot-Savartschen Gesetz laBt sich fiir jede einzelne Stromkreisstrecke fiir den in einem Punkt P erzeugten Feldanteil angeben: , / sin A' , H^ I ;- .,dx. In r (8) «! Die Rechnung fuhrt auf folgende Beziehung: Hy w 4 71 In ^ \z~lw /2 + i^ + VI Ik z-lwl2 A/cm (9) Setzen wir wieder unsere obigen Wendcidatcn und fiir die Liinge des Zuleitungsdrahtes l^ 4 mm ein, so erhalten wir: 30 35 AO 45 50 Abstand Hei/wendelmitte- Emissionsflache in mm 55 Fig. 4. Abliiingigkcii der Heizleistung von der Entfernung der Emissionsfliiche von der Heizwendelmitle. Bolzen 0: 0,6 mm, Objekt :" : 1,5 mm. Hy = 0,5 /' ' {^) [Oe] (10) (z in mm). In Fig. 3 finden wir auch Hy in Abhiingigkcit von z graphisch aufgetragen. Aus konstruktiven Griin- den betriigt der minimale Abstand der Emissions- fliiche von der Wendelmitte ca. 2,8 mm. Fiir diesen Fall erhalten wir fiir die beiden Feldstiirkenkompo- nenten folgende Werte: i/, = 7,3 [Oe], Hy^ 1,63 [Oe]. Der Einnuf3 dieses Storfeldes auf die Abbildungs- giite des Immersionsobjektives ist schwer zu bcur- teilen. Die obige Angabe fiir den Abstand zwischen Wendelmitte und Emissionsfliiche von 2,8 mm ist der konstruktiven Ausfiihrung der Bolzenkathode als Eiektronenquelle fiir die Elcktroncnkanonen ent- nommen. Beim Emissionsmikroskop kann die Emis- sionsfliiche bedeutend weiter von der Heizwendel weggeriickt werdcn, wodurch nach Fig. 3 die Stor- 200 ^ 150 '.no c a c ^ 50 Parameter Temperatur der Cmisslonsflache 2.5 30 35 40 <5 50 Abstand Heizwendelmrtte — [missionsflache in mm 5.5 Fig. 5. Axiale Verschiebung der Emissionsfliiche bci \cr- schiedenen Temperaturen in Abhangigkeit des Abstandes Emissionsflache-Heizwendelmiite. Bolzen 0: 0,6 mm, Ob- jekt 0: 1,5 mm. 40 E. B. BAS Fig. 6. Objektpraparation. feldstiirke der Heizwendel noch weitgehend vermin- dert werden kann. Es erhebt sich nun die Frage. wie sich die Bom- bardierungs-Leislung des Bolzens fiir eine bestimmte Objekttemperatur beim Wegriicken der Emissions- fliiche von der Heizwendel verandert. Diese Frage wurde experimentell gepriift, woraus die Kurven- schar in Fig. 4 resultiert. Die Messungen wurden mit einem W-Objekt durchgefiihrt und die Anord- nung war so getroffen, daB der Abstand zwischen Wendelmitte und Einspannstelle des Bolzens stets 11, 2 mm betrug. Bolzendurchmesser war d^ = 0,6 mm und Objektdurchmesser cIk =1,5 mm. Durch die Verlangerung des hochgeheizten Bolzenendes wird nun auch die axiale Ausdehnung des Bolzens ausge- pragter. Die gemessenen Ausdehnungen sind durch die Kurvenschar in Fig. 5 graphisch dargestellt. tJber den EinfluB des Abstandes Wendelmitte-Emis- sionsflache auf die Abbildungsgiite wurden noch keine systematischen Versuche durchgefiihrt. Wir wenden uns jetzt der Objektpraparation zu. Diese besteht aus drei Stufen: a) Praparation des Wolfram-Bolzens; h) Aufschmelzen des zu unter- suchenden Stoffes auf den Wolfram-Bolzen; c) Pre- paration der Emissionsflache. Der Wolframbolzen wird aus dem handelsiiblichen Wolframdraht hergestellt. Der meist angewendete Durchmesser betragt 0,6 mm. Zuerst werden Draht- stucke von ca. 300 mm Lange in einer Streckvor- richtung im Schutzgas bei ca. 1000 C gestreckt. Aus so gerichtetem Draht werden Stiicke von passender Lange herausgeschnitten und in einem Rekristallisa- tionsofen bei 3000 K rekristallisiert (Fig. 6a). Nun werden die rekristallisierten Bolzen in einen Halter eingesteckt und in eine Kathodenstrahlrohre ein- geschieust. Durch den auf die Stirnflache des Wol- fram-Bolzens konzentrierten Elektronenstrahl wird das Wolfram so weit geschmolzen, bis eine Kugel von gewiinschtem Durchmesser entsteht (Fig. 6b). Es stand uns im Elektronenstrahl eine Leistung von 14 kV < 10 mA = 140 W zur Verfiigung, womit Kugeldurchmesser von ca. 2 mm ohne Schwierigkeit erzielt werden konnen. SchlieBlich wird die Wolfram- kugel bis auf die Halfte abgeschliffen (Fig. 6c). Der nachste Schritt ist das Aufschmelzen des zu Fig. 7. Emissionsbild. untersuchenden Stoffes. Dieser Stoff kanninmassiver Form Oder in Pulverform vorliegen. Liegt er in mas- siver Form vor, so wird ein Stuck von geeigneter GroBe auf die Stirnflache eines wie oben vorbereite- ten Wolframbolzens mit Hilfe von Kollodium ange- klebt (Fig. 6d). Falls der zu untersuchende Stoff in Pulverform vorliegt, wird eine bestimmte Menge von diesem Pulver bzw. Pulvergemisch in einer kleinen PreBform auf die Planflache der Halbkugelkalotte des Bolzens aufgepreBt (Fig. 6e). Es kann ein wenig Kollodium als Bindemittel zugegeben werden. Der Wolframbolzen mit aufgeklebtem bzw. aufge- preBtem Praparat wird wieder in den Elektronen- schmelzofen eingeschleust und durch Elektronen- beschuss auf das Wolfram aufgeschmolzen (Fig. 6/). Da Wolfram einen hohen Schmelzpunkt besitzt und das Aufschmelzen unter Umstanden in Bruchteilen einer Sekunde erfolgt, besteht sehr geringe Wahr- scheinlichkeit fur eine Legierung mit Wolfram. SchlieBlich kommt die Fertigstellung des Objektes. Dafur wird zuerst die Schmelzkugel auf dem Wol- frambolzen auf den gewunschten Durchmesser rund- geschliffen und dann die Emissionsflache plange- schliffen (Fig. 6^). Bei diesem letzten Schritt ist zu beachten, dass die resultierende Dicke des zu unter- suchenden Stoffes auf dem Wolfram ausreichend ist. Die SchluBphase der Praparation bildet die feine Politur der Emissionsflache. Selbstverstandlich konnen in vielen Fallen Bolzen aus voUeni Material des zu untersuchenden Stoffes herausgearbeitet und in die Bolzenkathoden-Anord- nung als Objekt eingebaut werden. Wir haben aller- dings zurzeit diesbezugliche Erfahrungen nur mit hochschmelzenden Metallen Molybdan und Tantal gemacht. Zum SchluB zeigt uns Fig. 7 ein emissionsmikro- skopisches Bild, welches mit den Objekten in Bol- zenkathodenform hergestellt wurde. Richtstrahlwi'ite der kalten Kathode 41 LiTERATUR 1. Bas, E. B., Mitteilungen des Inst. f. techn. Physik a.d. Eidg. Technischen Hochschule Zurich, Nr. I (1950). 2. — G. F. F. Milleihinscn 10, 17 (1954). 3. — Optik 12, 377 (1955). 4. — Z. angew. Phys. 7, 337 (1955). 5. Honda, R. und Konno, S., Phil. Mag. 42, 121 (1921). Richtstrahlwerte der kalten Kathode L. Wegmann und M. Gribi Tiiih, Tciiihcr ii. Co., Ziirich Nachdem die Messungen des Geschwindigkeits- spektrums durch MoUenstedt (2) den theoretischcn Nachweis erbracht haben, daB die kalte Kathode nach Induni zur Speisung von Elektronenmikrosko- pen geeignet ist, konnte von der Anwendungsseite her gezeigt werden. daB es durchaus mogUch ist, das Trub-Tauber-Mikroskop fiir die histologische Forschung einzusetzen, wenn man als Kriterium dafiir die Auflosung der Doppelstrukturen in den Mitochondrien und der Palladeschen Korner be- trachtet. Was neben dem sicheren Vorteil der Ein- fachheit im Betrieb jedoch oft noch als Nachteil empfunden wird, ist die mangelnde HeUigkeit der kahen Kathode bei hoheren VergroBerungen, was bei langerem Arbeiten mit Schnittpriiparaten als ermiidend empfunden wird. Diese Lage hat AnlaB gegeben, die Intensitat des emittierten Elektronenstromes der kalten Kathode genauer zu untersuchen. Einige Ergebnisse sollen hier dargelegt werden. Fig. 1 zeigt das im Triib-Tauber-Mikroskop ver- wendete Beleuchtungssystem (1,3). Der Kathode (K) K B, Fig. 1. Beleuchtungs-Systcm mit kalter Kathode. K = Kathode A = Lochanode Ba = Anodenblende Be = Kondensorblende O = Objektebene a= virtueller kathodenseitiger OfTnungswinkel fi = maximale Beleuciilungs- apertur steht die eng anschlieBcnde Lochanode (A) gegen- iiber. Den AbschluB des Kathodcnraumcs mit er- hohtem Gasdruck bildct die Anodenblende (Bj\). In der magnetischen Kondensorlinse mit der Konden- sorblende ( Bf.) w ird das ElektronenbCindel gesammelt und — bei hellster Beleuchtung des I'riiparates — in die Objektebene (O) fokusiert. Die vorliegenden Ergebnisse wurden erzielt mit einer Lochanode von 8 mm Durchmesser in 9 mm Abstand von der Kathode. Der groBerc Abstand von der Kathode wurde notig, weil die Untersu- chungen auf hohere Spannungen (bis 80 kV) ausge- dehnt wurden. Der Abstand Anode-Anodenblende ist fijr die Entladung nicht kritisch. sobald er ober- halb ca. 30 mm liegt. Zur Messung der Richtstrahlwerte dieser Kathode wurden die Blenden B^ und Be, sowie — bei aus- geschaltetem Kondensor — eine Blende (Bq) in der Objektebene benutzt. Es zeigt sich rasch, daB man zu untcrschiediichen Werten kommt, wenn man die Apertur fiir die verschiedenen Blenden aus deren wirklicher Distanz zur Kathode berechnet. Dies ist aus dem Verlauf der Elektronenbahnen im Bcschleunigungsfeld leicht erkliirlich: nach Fig. 2 , muB der virtuelle, fiir die R xlO 56 kV 0.5 1 1.5 2x10 oc 3 Fig. 2. RichlstrahKscrtc dor kalten Kathode in Amp. /cm- als Funktion des kathodenseitigcn OtVnungswinkels. 42 W. C. NIXON Berechnung der Aperturen maBgebende Emissions- fleck hinter der Kathode liegen. Der Richtstrahlwert i?(a) fur einen bestimmten Offnungswinkel a ergibt sich aus dem durch eine Blende des Durchmessers 1 2 r flieBenden Elektro- nenstrom / zu 71 d^ n a wo a der zu r gehorige Off"nungswinkel und d der Durchmesser des Emissionsfleckes ist. Dieser Durch- messer wird am einfaclisten festgestellt durch elek- tronenoptische Abbildung in die Objektebene (O). Von hier aus kann er durch Rechnung in den Emis- sionsfleck zuriickprojiziert werden, und zwar in den virtuellen Emissionsfleck, dessen Abstand auch der Berechnung von a zugrunde liegt. Dabei wird der virtuelle Emissionsfleck in einem solchen Abstande von der Kathode gewahlt, daB sich fur Messungen mit Blenden in verschiedenen Abstiinden von der Kathode (z. B. Ba und Bq) dieselben Werte fur i?(a) ergeben. Fur die vorHegende Anordnung ergab sich auf diese Weise ein Abstand zwischen wirklichem und virtuellem Emissionsfleck von 100 mm. Bei einem Totalstrom der Emission von 0,5 mA erhielten wir damit die in Fig. 3 eingetragenen Richtstrahlwerte. Die Messungen wurden an einem mehrere Tage eingebrannten und somit iiber lange Zeit stabilen Fleck durchgefuhrt. Es ist auffallend, daB man es bei der Emission der kalten Kathode off'enbar mit einem Hohlstrahl zu tun hat, welcher bei einer Apertur von 1,5 10"^ seine groBte Intensitat ausstrahlt. Der Unterschied im Richtstrahlwert zwischen diesem Off'nungswinkel und den bisher benutzten von 0,3 bis 0,5 10"^ ist ofi'ensichtlich wesentlich groBer als die durch Varia- tion der Beschleunigungsspannung erzielten Unter- schiede. Immerhin kann auch mit Steigerung der Beschleunigungsspannung noch eine Erhohung des Richtstrahlwertes erreicht werden. Da bei der in Fig. 2 gezeigten Anordnung die Flachendichte j des Elektronenstromes im Praparat und damit die Helligkeit im Bild gegeben ist durch und anderseits fi gegeben ist durch die weiteren Abbildungsbedingungen, so kann die grdBte Hellig- keit dadurch erreicht werden, daB a = 1,5 ' 10~^ ge- macht wird. Es ist auf diese Weise gelungen, durch Abanderung der Distanzen zwischen virtueller Kathode und Kon- densor auf den giinstigsten Wert und durch gleich- zeitige Erhohung der Beschleunigungsspannung auf 60 kV im Triib-Tauber-Mikroskop, Typ KM4 eine Helligkeitssteigerung im Endbild von einem Faktor 6 zu erzielen. Die Forderung der Histologen konnte also erfiillt werden, und zwar zeigt die mit der neuen Beleuchtungseinrichtung erzielte Auflosung, daB die Geschwindigkeitsverteilung der Elektronen auch iiber diese Winkel geniigend ist. LJber weitere Experimente mit demZiel, die Richt- strahlwerte fiJr kleinere Offnungswinkel zu erhohen, soil an anderem Orte berichtet werden. LiTERATUR 1 . lNDUNi,G.,Comptes rendus du colloque CNRS a Toulouse 1955, S. 189. 2. MoLLENSTEDT, G. und DuKER, H.,Z. Natiirforsch. 8a, 79 (1953). 3. Wegmann, L., Optik 10, 44 (1953). Summary of the Proceedings of a Symposium on X-Ray Microscopy and Microradiography, Cambridge University, England, August 16—21, 1956 W. C. Nixon Cavendish Laboratory, Cambridge — CO 2— >— cc llm/'(z)=l; lim/'(z)^=0 (8) ist. Dann lautet die Definition der asymptotischen Brennweite v und der asymptotischen Brennpunkts- lagen z,,i und z,.! (der ,, asymptotischen paraxialen KenngroBen") lim 3— » + 0O s(.z) + Z + Zj,2 0; lim [/(z)-(z-z,i)] = 0; (9) und es gilt St - t's (10) KZI Abb. 1. Zur Festlegung der Losungen i(r) und / (r) der paraxialen Bahngleichung und zur Definition der paraxialen asymptotischen KenngroBen. 4 — 568204 Electron Microscopy OD/eHi Abb. 2. Zur Veranschauliciiung der Forderung, daR das virtuclle Zwischenbild in der asymptotischen Brennebene zvi des Projektivs liegen soli. Dann entsteht das reelle Zwischen- bild in der Ilbene r/i. Bei dieser Wahl von s und / gcben die beiden komplexen Zahlen A und B DurchstoBpunkt und DurchstoBrichtung der Einfallsasymptoten durch die asymptotische Brennebene z = z„i des Projektivs an. Wenn man also (und das muB man tun, wenn man das reelle Biid des Objektes in die Brennebene des Projektivs bringen will) Zi z,, wiihlt, also die Ebene des virtuellen Zwischenbildes (d. h. des Bildes. das das Objektiv erzeugen wiarde, wenn das Projcktiv ausgeschaltet ware) mit der asymptotischen Brenn- ebene des Projektivs zusammenfallen liiBt (vergl. Abb. 2), ist Wi = A; Ui B. (11) Fiir die Ausfallsasymptote. d. h. fiir groBe positive z gilt nach (7) Z — Zy9 u (z) = -A + Bv + +00 + '-^^ HOBJOd '"/ s(^)BA$)dl (12) Wirdefinieren die asymptotischen Bildfehlerkoef- fizienten B*, C*, c* ... durch // (z) + A Zn-l Bv lim Z — Zj,2 = 5* «;-//; : 2(F* //*)//j»i//i-!- + (F*-/7*)//^//,'- (D* C*)//,'^//[ + + (C* + ic*)uiu[ + {E* + ic*)u\i(^. (13) Der auf der linken Seite von (13) stehende Aus- druck ist die durch die ProjektivvergroBerung divi- dierte Abweichung der Seidelschen Bahn von ihrer paraxialen Nahcriing in dor weit vom Projcktiv cntfernten Endbildcbene. Man kann durch Vergleich von (12) und (13) unter Beriicksichtigung von (6) in bekannter Weise Integralausdriicke fiir die asvmptotischen Bildfehler- 50 FRIEDRICH LENZ koeffizienten gewinnen. Beispielsweise gilt fiir die asymptotische Verzeichnung E* .[i^^\(iAs't^(iP's^~s't- ■^'ss'^t dz, (14) |[g/,v-^ir')^»- ^ ff -^-fi'\s''s't + ^:^(i'ss'-^t-^fts'^t dz (15) Oder nach Vereinfachung durch einige partielle In- tegrationen E* 8v- + 00 \ii'^Y^(il^''^Y^(^'Y^dz, (16) - \[[i'^\(^")s'dz. (17) Als Beispiel wollen wir fiir den Grenzfall hoher VergroBerung die asymptotische Verzeichnung im Glaserschen Glockenfeld [5] 5 = B. if d. h. /? (^ mit A" ieB^dV \ 2 m V I (18) berechnen und mit der iiblichen Verzeichnung im System ohne Blende vergleichen. Wir erhalten fiir die isotrope asymptotische Verzeichnung mit der Abkijrzung oj = Kl + A^ 2k^ + 3 d'E* 4 or (4 k" + 3) 3 + Tik + ^,, ,o — rr sin- TT CO + -, — cotg.Tfo (19) 2 (4 k- + 3) 4 CO und fiir die anisotrope asymptotische Verzeichnung ^2 ^* ^ ^^ (2 k'^ + 1) - -^-^ sin 2 71 CO, (20) 8(o^ 16 ko/ wahrend die Berechnung der in (2) bzw. (3) einge- henden Verzeichnungskoeffizienten e, E im System ohne Blende d E = - — -o 1 +A sm 4o/ '71 \0J) 71 COtg— + CO 1 4A"^-3 + -- 24 4 A-^ + 3 6 (6 A" - 3) sm k sm — Oi CO + i . 9 TT + - sm^ — 8 CO 71 5k^ — sm' — 24 CO (21) und (2 A- + l)7rA- / 2 -2^ d-e = s^ 1 + A' sm — 8 CO'' k^ - \ . 71 71 sin— COS 4 A CO ca k or 71 sm — cos — 4 CO CO (22) ergibt. In Abb. 3 sind zum Vergleich die asymptoti- schen Verzeichnungskoeffizienten zusammen mit den gewohnlichen Verzeichnungskoeffizienten im System ohne Blende graphisch dargestellt. Die experimentelle Bestimmung der Verzeich- nungskoeffizienten geschieht meist durch Ausmes- sung der Aberration A//., im elektronenoptischen Bild (vergl. Abb. 4; dort ist zur Vereinfachung der Zeichnung nur die radiale Komponente von Amj = Ar gezeichnet). Haben dabei die in die Projektiv- linse einfallenden Elektronenbahnen achsenparallele Einfallsasymptoten, so gilt in unserer Bezeichnungs- weise Ar E* V (/.". (23) Waren dagegen die Elektronenbahnen beim Durchgang durch die Ebene des reellen Zwischen- bildes (der Ebene = - z,i) achsenparallel, so wurde — =Ef a. r (24) ? a'f^^ X / J "~-~-~^ ^ 7 \ 2 \ K- Abb. 3. Die asymptotischen und die ublichen Bildfehler- Icoeffizienten der isotropen und anisotropen Verzeichnung fiir das Glasersche Giockenteld. Asymptotische Bildfebler 51 •u.E'tf'ra: v\ *\ y,- ~k< 3 \ \ Cg^£*v3^£/3 (28) Abb. 4. Abb. 5. Abb. 4. Zur Vcranschaulichung der Bcdeutung des isotropen asymptotischen Verzeichnungskoeffizienten E*. Abb. 5. In dicser Abbildung wird veranschaulicht, in welchem Linsenstiirkcnbereich die Anniihcrimg von £*i- durcb Co// brauciibar ist. In Abb. 5 sind E*v-, Ef- und die in der Literatur hiiufig niiherungsweise anstelle von £*v- verwandte GroBe C^j f fur das Glasersche Glockenfeld als Funktion der Linsenstiirke A- aufgetragen. In der Literatur sind mehrfach [1, 2, 3, 6] Metho- den zur experimentellen Bestimmung der Bildfehler durch Ausmessung verzerrter Schattenbilder be- schrieben worden. Wenn das schattenwerfende Objekt im feldfreien Raum vor oder hinter der Linse liegt, miBt man dabei in Wirklichkeit nichts anderes als die asymptotischen Bildfehler. Am bekanntesten ist die Messung des ,,OfTnungsfehlers" aus der Schat- tenbildverzeichnung. in Wirkiichkeit wird dabei aber nicht der OfTnungsfehlerkoeffizient gemessen, son- dern der Koeffizient der isotropen asymptotischen Verzeichnung. Da aber fiir schwache Linsen wegen + oc JO^'-^^-fi- c. + 00 (25) ( /r^.-) + 00 \i^f^rr-l,i>ir)'>^ + 00 (26) [fd: f^v /'• (27) dz besteht, sind die cntsprechcnden Messungen nur mit einem relativ geringcn Fehlcr behaftet und durchaus zur niihcrungswcisen Bestimmung des OlVnungsfchlcrkocftizionten C'^ gecignet, und zwar umso besser, je schwacher die Linse ist. Die von Liebmann [7] durchgefiihrten numcrischen Berechnungcn der Vcrzeichnungskocffi/icnten bczie- hon sich auf die asymptotische Verzeichnung. Es ist aus diesem Grund nicht verwundcrh'ch, daB ihre Abhiingigkeit von der Linsenstiirkc einen grundsiitz- lich andcrcn Verlauf hat als die, die sich aus den Glaserschen Bildfehlerintcgralcn crgeben wiirde. Die Abhiingigkeit der von Liebmann berechneten Ver- zeichnungskoeffizienten von der Linsenstiirkc ist viel- mehr von demselben Typus wie die Kurvcn fijr E* und ('* in Abb. 3; d. h. E* hat fiir k- --- einen positiven cndlichen Wert, steigt mit zunchmcndcr Linsenstiirkc zuniichst etwas an, durchliiuft bei etwa einem Sechstel der teleskopischen Linsenstiirkc cin Maximum, wechselt etwa bei der halben teleskopi- schen Linsenstiirkc sein Vorzeichcn und geht mit Anniiherung an die teleskopische Linsenstiirkc gegen — oo . Als Beispiel fiir das Zusammenwirken der Bild- fehler zweier Linsen werde die isotrope Verzeichnung eines aus zwei Linsen bcstchcndcn Systems bercch- net. Durch Beschriinkung auf die isotrope Verzeich- nung wird aus (2) und (13) U.y = Vp U^ + Vp £* Ml M J (29) (30) Setzt man Hi aus (29) in (30) ein und vernach- liissigt Glieder von hoherer als 3. Ordnung in u„, so erhiilt man «2 = K ^P "o + iylE* + £o) Vo Vp I'l Wo • (3 der auch in Abb. 5 erkennbare Zusammenhang Fiir hohe ObjektivvergroBerungen ( | F,, | ; 1) wird in (31) das Glied, das die Objektivverzeichnung £„ cnthiilt, nur cine vernachiiissigbar kleine Rolle spie- Icn. Die Gesamtverzeichnung des Systems ist in diesem Fall also praktisch nur durch die asympto- tische Verzeichnung des Projektivs bestimmt. Liegt dagegegen in einem System aus mehreren Linsen vor dcm letzten Projektiv noch cine oder mchrere Linsen geringer VergroBerung, so ist auch deren Verzeich- nung (wcnn cs sich um F'rojektivlinsen handelt. deren asymptotische Verzeichnung) zu heriicksichtigen. Literatur 1. VON Ardenne, M.,Z. Physik 117, 602-611 (1941). 2. BoERSCH, H., Z. tech. P/iys. 20, 346-.'?50 (1939). 3. DossE, J.,Z. Physik 117, 722-753 und 118, 375-383 ( 1941). 4. Glaser, W., Grundlagcn der Elcktronenoptik. Springer- Verlag, Wicn, 1952. 5. — Z. Physik 117, 285-315 (\')4l). 6. Heise, F., Opiik 5, 479-489 (1949). 7. Liebmann, G., Pioc. Phys. Soc. B 65, 94-108 (1952). 8. RusKA, E., Arch. Elektrotech. 38, 102-130 (1944). Zur Errechnung elektronenoptischer Feldverteilungen mit geforderten Abbildungseigenschaften K. W. J. PiCHT Institiit fiir f /won't ische Pliysik cler Pad. Hochschule, Potsdam-Giiebtiitzsee In der Elektronenoptik ist es bisher im allgemeinen iiblich, von einer gewiihlten Feldverteilung langs der Symmetrieachse auszugehen — z. B. von der soge- nannten Glockenkurve — und fiir diese zunachst Brennwelte und Lage der Hauptpunkte sowie da- durch gleichzeitig die Lage der Brennpunkte zu berechnen. Aus diesen GroBen findet man auch so- fort die fiir eine gewiinschte VergroBerung der Abbil- dung erforderliche Lage der Objekt- sowie der Bildebene. AnschlieBend lassen sich dann fiir diese Bildebene auch die Abbildungsfehler berechnen. Wiihlt man die Feldverteilung langs der Achse — aus der sich ja die Feldverteilung im Raume berech- nen laBt — so, daB ihre mathematische Darstellung noch einige zunachst in ihrer GroBe nicht festgelegte Parameter enthalt, so werden diese Parameter auch in den Ausdriicken fiir die Abbildungsfehler auftre- ten. Sie konnen dann gegebenenfalls nachtriiglich so gewahlt werden, daB die oder doch einige der fiir den gedachten Anwendungszweck des elektro- nenoptischen Abbildungssystems besonders storen- den Abbildungsfehler moglichst kleine Betriige an- nehmen. Ob dies Verfahren bisher in der Literatur bereits vorgeschlagen oder praktisch tatsiichlich benutzt wurde, entzieht sich meiner Kenntnis. Auf der 6. Tagung der deutschen Gesellschaft fiir Elektronenmikroskopie in Miinster im Miirz 1955 hatte ich zur systematischen Errechnung der Feld- verteilung von Abbildungsfeldern, die bestimmte Abbildungseigenschaften sowohl bez. der VergroBe- rung und des Abstandes zwischen Objekt- und Bildebene als auch mit Bezug auf eine moglichst geringe GroBe der bei dieser Abbiidung auftretenden Abbildungsfehler besitzen, eine andere Berech- nungsmethode vorgeschlagen, die in der Zeitschrift Optik, 12, 433, 1955 veroffentlicht wurde. Bei dieser damals vorgeschiagenen Berechnungs- methode war ich ausgegangen von der 1932 von mir angegebeneni Form der Differentialgleichung paraxialer Elektronenstrahlen P" + 3 /O)' 16 ^-) P-0 fiir elektrische Felder, bzw. 3 /0'(z)\2 1 W"{z)+W{z) 16\ CD-/ -^cP^,^''^^^ In diesen Gleichungen ist -e (mit e > 0) = Ladung der Elektronen, / •- _ P(z) = o(z)l'0-(z) bzw. ^r(z) = H'(z)l/(D"(z) mit H'(z) = ^(r) cos ;^(z) ; /o (r) sin ;/(z) = ^(z)e'^ X = y)-a) O) = 0)n^ " 2 f ImJ 10" (z) m{z) dz = - e 2 m J mi=)dt. {dco/dt = Larmor-Prazession,] 1 m o (D-(z) = (D(z) - t/= :, V", 2 - e O (z) = elektrische Potentialverteilung langs der z- Achse, f93(z) = magnetische Feldstarke 93 langs der z- Achse. Q, ip, z = raumfeste Zylinderkoordinaten (der Bahn der Elektronen), deren z- Achse mit der Symmetrieachse des Feldes zusammenfallt, q,X,z = Bahnkoordinaten der Elektronen in einem sich um die z-Achse (Symmetrieachse des Feldes) mit der Larmor-Prazession drehen- den Zylinderkoordinatensystem. Die Methode der 5erechnung bzw. Errechnung einer geeigneten Feldverteilung, die bei vorgege- benem Abstand zwischen Objektebene und Bildebene und einer hierbei geforderten VergroBerung eine Abbiidung mit moglichst geringen Bildfehlern liefert, besteht darin, eine von mindestens einem, besser von mehreren Parametern Pi abhangende Kurve 1) P =P(z) 'V{z,p^,p..,...pn) =0 als Bahnkurve der paraxialen Elektronenstrahlen so zu wahlen, daB sie die z-Achse in zwei Punkten schneidet, deren Abstand dem Abstand zwischen fiir magnetisch-elektrische Felder. 1 J. Picht, Ann. Physik (5) 15, 926-964(1932). J. Picht, finfiihrung in die r/;eorie der Elektronenoptik (E Th EO). Johann Ambr. Barth, 2. Auflage, 1957, § 14 u. § 20. Errechmmg elektronenoptischer Feldveitcilungcn 53 Objektpunkt (z =7^) und Bildpunkt (z = z,,) ent- spricht, daB also 2) P(z,) ^ und P(r,) und daB sie die r-Achse in diesen Punkten so schneidet, daB 3) mit B - laterale VergroBerung. AuBer diesen drei Forderungen muB das zu wiih- lende P(z) [bzw. W{z)] noch folgende Bedingungen erfiillen: 4) P" U) P(z) ^0 fiir Zg ^z <,zt, . Aus Forderung 2) und Forderung 4^ folgt, daB auch gelten muB: 4 a) P"(zg) = P"(z<,) = mit lim P" (z) 2->2g P(Z) C^O mit C = constans Die drei fiir die angegebenen Teilabschnitte zwi- schen z z„ und z z^ geltenden Bahnfunktionen gehen — wenn man die eingekiammerten -Zeiclwn als giiltig annimmt und noch a-z„ 2zj, - .-rB 2 fl(3B : 1) ■ V^B und lerner: 2jZ c = a(B+l)' h = 7i B B+1 ' Zo ( = Zj + c) = f I 1 waJTlt, also 2 Zb - .T • B 2.T «(Bfl) B-1 IV Az) = B 1+3-B 2a z + + sm a (B \)(z z.) W,{z)- -^a( 5) Die mit diesem P(z) [bzw. lV{z)] berechnete Feldverteilung (I>(z) bzw. (oder: und) ''-^(z) muB praktisch — u. zw. moglichst einfach — realisier- bar, also herstellbar sein. Die vorgeschlagene Berechnungsmethode wurde inzwischen unter meiner Anleitung von einem mei- ner Schiiler, meinem derzeitigen Assistenten Herrn Dipl.-Phys. Horst Hansel, in einer als Doktor- Dissertation eingereichten Arbeit fur ein Magnet- feld auf ein spezielles Beispiel angewandt, iiber das zunachst kurz berichtet sei. Sind Zg und Zf, wieder die langs der Symmetrieachse des Feldes gemessenen Koordinaten der (achsen- senkrechten) Objekt- bzw. Bildebene, so wird in der Arbeit von Herrn Hansel fiir den paraxialen Strahlverlauf zunachst angenommen, daB er mit Bezug auf ein sich mit der Larmor-Prazession um die Systemachse (z-Achse) drehendes Koordinatensy- stem darstellbar ist durch die drei folgenden. ab- schnittsweise geltenden Gleichungen W^iz) = a(z-Zg) mit Zg^z,_^^z^ I a Zgj, W^ (z) = azj^ + - z -f sin ( \ c I mi t Zj ( ^ ) z ( r^i ) Zo ( z^ '■■€), ^3iz)= -^a(z-z,) mit (Zi-rC = )Z2(^)Z(^)Z6 schreibt — an der Stelle z z, bzw. Z = Zi + C = Za stetig ineinander iiber, so daB z = Zi und Z = Zi + C = Za als ,,Nahtstellen" der drei Teilkurven angeschcn werden konnen. Geometrisch besagt dies, daB der Strahlverlauf zwischen Zg und z, einerseits, zwischen z.. und z,, ande- rerseits als geradlinig angenommen wird, (z., - z,) c also gewissermaBcn die eigentliche ..Feldliinge" dar- stellt. Da dies bedeulcn wurdc, daB das magnetische bzw. magnetisch-elektrische Feld an den Stellen z Zj und z Z2 abbricht, dies aber in der Praxis nicht der Fall sein kann, muBte der Strahlverlauf und damit auch die Feldverteilung noch etwas moditi/.iert wer- den. Zu diesem Zwecke wurde der zunachst vorgege- bene Strahlverlauf dahin geandert, daB die oben angegebenen Funktionen Wj{z) mit / 1 h/w. 3 nicht bis Zi (fliry I ) und auch nicht von z-, z, c ab (fury 3) gelten, sondern nur bis zu (bzw. von) diesen benachbarten Werten (ab). Aus diesem Grunde sind oben bei Angabe der Giihigkeitsgren- zen der Teilfunktionen die Glcichheitszeichen be- reits eingeklammert. Bezeichncn wir die ncuc obere Grenze fiir IV^iz) durch Zi ti, die neue untere Grenze fiir H',(z) durch Zi ■• f>, so ist der gewiihlte paraxiale Strahl- verlauf jetzt darstellbar durch 54 K. W. J. PICHT W^{z) = a{z-z,) mit Za<.ZQ angeben, in dem noch x{z)= - {z-z^ c ist. Fur die magnetische Feldstarke findet man dann die drei stetig ineinander ubergehenden Ausdriicke: fur Tl Ei^{z-Z^^O ^ -e y a{z-Zg) + f{z-z^ fiir j:(z z^)^c ) B, (z) = 8mf/ 1^2 (B+ 1)2 sin [ia(B+l) {z-z^)]- -f"iz-z,) sin[ia(B+lKz-Zi)]-ia(B-l)(z-Zi) + -\ a{z-^^-Zg)^f{z-z-^) und fiir c ^{z -z^ ^- £2 71 BAz) 8m U f"(z-z^) (z-Zh)+fiz-Zj) B In diesen Ausdrijcken fiir die magnetische Feld- starke auf der Symmetrieachse des Feldes bedeuten wie iiblich m die Masse, e (mit e > 0) die Ladung des Elektrons, U h ('" 'e)vl, ferner Zg = Lageko- ordinate des Achsenschnittpunktes der Objektebene, Zb entsprechend der Bildebene, B = paraxialer Abbil- dungsmaBstab, d. h. die gewunschte VergroBerung. a ist eine Konstante, die prinzipiell noch frei verfiig- bar ist, um durch ihre Variation die Abbildungs- giite zu beeinflussen. Ihre geometrische Bedeutung folgt aus IVi(z) = a(z Zg), namUch, daB a = dem Tangens des Neigungswinkels der den Berechnungen zugrunde gelegten Elektronenbahn in ihrem objekt- seitigen Schnittpunkt mit der Achse, also an der Stelle der Objektebene ist. Zi bezeichnet die z-Koor- dinate der Stelle der Symmetrieachse, an der — in gewissem Sinne — das magnetische Feld zu wirken beginnt oder als vorhanden zu gelten hat. /(z) ist die ,,Korrektionsfunktion", die das abrupte Ab- brechen des Feldes an den Stellen z = Zi und z = Zi + c verhindert. c bezeichnet daher — in gewissem Sinne — die ,,Lange" des magnetischen Feldes. Zur Beeinflussung des Korrekturzustandes dieses Feldes kann man — he i fester Vorgabe des Abstandes {Zf, " Zg) zwischen Objekt- und Bildebene sowie ferner: der Vergrofierung B — folgende GroBen prinzipiell variieren: 1) a = tang der Neigung des zur Berechnung benutzten Elektronenstrahls im Ach- senschnittpunkt der Objektebene, 2) c = „Feldlange", 3) Zi = Stelle des „Feldanfangs". Tn manchen praktischen Fallen wird es moglich sein, auch noch 4) z^ - Zg = Abstand der Bildebene von der Objek- tebene zum Zwecke der Bildfehlerkorrektion zu variieren. In der genannten Arbeit von Herrn Hansel sind derartige Fehlerberechnungen durchgefiihrt und der EinfluB einer Variation der freien Parameter auf die Bildfehler diskutiert. Doch auf diese Diskussion sei hier nicht niiher eingegangen. Wohl aber wollen wir hier noch kurz an Hand eines Beispiels zeigen, daB es nicht unbedingt notig ist, von einer Elektronenbahn auszugehen, die aus mehreren abschnittsweise geltenden Gleichungen darzustellen ist. In der oben genannten Annalen-Arbeit aus dem Jahre 1932 hatte ich darauf hingewiesen, daB eine Losung der fur elektrische Felder geltenden Differen- tialgleichung 3 /(D'\- 16\0~/ fur die Funktion O 2p 2p Lentilles electroniques magnetiques 2p 55 P = l/z-{Ci-/p {±2pAV3yz) 2p + C,'Nj,(±2pAV3yz)} ist. Geht man nun umgekehrt von dieser Bahnglei- chung P P(r) aus und modifiziert sie so, daB sic einem vorgegebenen Abstand z,^~Zg zwischen (par- axialer) Bildebene und (paraxialer) Objektebene sowie einer gewunschten VergroBerung B angepaBt ist, so wird man — wie wir hier ohne Bevveis mitteilen^ — zu folgenden Gleichungen gefiihrt: 2p rJ±2pA*l/a-^ + 2p C*-N, (..... /.i;f^)^o. 2p Jp ±2pA- a Zb Zb-Z, 9 I + 2p + C*nA ±2pA* Zb-C a Zb 0, 2p ';>-! 2/7/4' f + C' + Zb •A^P-i( 2p ±2pA* y a Zb-C •■ip Jp-x{^ ±2pA* a Zb Zb~Zg + 2p C*-N, '-{'"^■\'-m) mr exp — Dp. \3pA* Diese Gleichungen enthaltcn die 7 (bzw. 8) Para- meter i!;> a (bzw. «, A*), C*, /;, c\ Zy, (r^ Zg) - h, B ?■, Zg und von denen die bciden letzten, niimlich Z(, B!'p durch die Aufgabenstellung vorgcgeben sind. 3 weitere GroBcn sind dann durch das Bestchen der 3 Gleichungen bestimmt, so daB noch 2(3)der GroBen — z. B.«,coderzg,/4*oderr, C* oder /4*,/7, r^usw. — frei wiihlbar sind und so bestimmt werden konnen, daB die Abbildungsfehler moglichst gering werden. Das zugehorige Feld, das die den Betrachtungen zugrundegelegte Elektronenbahn liefert, ist dann bestimmt I. im rein elektrischen Fall durch 2p O (z) = C exp 8 3 3 A- iz-c) m + -2e Vq 2. im elektrisch-magnetischen Fall durch m 0(z) = — -[(^(z))^ + ^;^] 2e V^{z)^ t- met) W" w 3 /(IV 1 6 \ O" )- mit \V" W P P Setzt man speziell p = \, also /? - 1 « 0, so muB man, um fiir B/- einen moglichst groficn negativen Wert zu erhalten, fiir C* einen moglichst kleinen (positiven) Wert wiihlen. Lentilles electroniques magnetiques Regies de leur construction et expressions universelles de leurs caracteristiques electro-opliques P. DURANDEAU Laboratoire d'Optique Electronique La construction rationnelle des lentilles electroni- ques magnetiques demande la connaissance : {a) des regies qui decoulent de Tetude de leur aimantation: {h) des expressions de leurs caracteristiques electro- optiques. Circuit magnetique — forme de la topographic dii champ. — II est essentiel de rassembler les amperes- tours d'excitation d'une lentille magnetique selon un champ presque uniquement localise dans ia region de Tentrefer : ce resultat n'est pas obtenu avec un circuit magnetique mal etudie (fig. I). On aboutirait a cette concentration si la pcrmeabilite magnetique ctait infinie mais, en pratique, il suffit que Tinduc- tion soit inferieure a 12.000 gauss. 56 P, DURANDEAU CxcitotiOn nl ,0000 ctirtp t ,.,, CntrrfrK 5 w i mm Fig. I. Pour un circuit magnetique mal etudie un champ non negligeabic cxiste dans le canal des pieces poiaires. Ce champ doit etre elimine pour plusieurs raisons (2). La forme a donner (fig. 2) au circuit magnetique (2) pour qu'il en soit ainsi, tient compte de la varia- tion du flux le long des noyaux poiaires, et du circuit (2, II). C'est rinduction dans le nez des pieces poiaires qui conditionne ensuite Tetalement de la topogra- phic du champ. (a) Si Texcitation est inferieure a 1000 S amperes- tours {S, entrefer en millimetres) I'experience montre (2) que, quel que soit le diametre des pieces poiaires, la topographic fournie par la lentille est celle qui correspond a une permeabilite magnetique infinie (fig. 3), cas pour lequel le calcul est aise (I, 6, 7, 9). Dans ce cas la topographic du champ est assimi- lable a celle que donnerait un solenoi'de de meme longueur S que I'entrefer (3) de rayon egal aux deux tiers du canal et evidemment de meme excita- tion que la lentille (fig. 4). La valeur du champ maximum est alors : ^i , N ^ \ \ N WW \ ;^^ \ f ' ^ J r Fig. 2. Forme du circuit magnetique qui permet d'obtcnir le rassemblement des amperes-tours d'excitation de la len- tille comme si la permeabilite du fer etait infinie : («) forme tronconique des noyaux poiaires : angle de 1 a 1 5 " . (/>) Epais- seur £>! au moins egale a /•/2. (c) Epaisseur e.2, telle que Taire de la section de I'enveloppe exterieure soit du moins egale a .t/-. \ V/ N\^ '^ r* — ' -^^ 1 ^Vx^ ^ Fig. 3. Ces pieces poiaires percees d'un canal de meme dia- metre D et espacees d'un meme entrefer S donnent meme topographic pour une meme excitation inferieure a 1000 5 ampere-tours (5, en millimetres). Cette topographie est celle qui correspond a une permeabilite magnetique infinie. AnNI 'M- K^- + 0.45Z)' Le principal interet de cette assimilation est de faire apparaitre un parametre geometrique carac- teristique de la lentille : L = VS" + 0,45 D^. L'expression de la topographie qui resulte de cette assimilation est generalisable a une lentille dissymetrique (fig. 5). ib) Si Texcitation est superieure a 1000 5" tout se passe comme si 5 et D etaient multiplies (fig. 6) par le facteur : /;; NI-WOOS T0005 ni est un coefficient numerique qui depend de la forme des faces poiaires. II est minimum et proche Fig. 4. Pour une permeabilite infinie et en pratique pour une excitation inferieure a 1000 S amperes-tours, la topographie obtenue est assimilable a celle d'un solenoide de longueur 5, de diametre - ., D et d'excitation NI. En tout point de I'axe rinduction a pour expression B iTlNI (cos a + cos /3). LentiUes electroniques mai^tu'tiques 57 Fig. 5. Generalisation a line lenlille dissymetrique dc Texpres- sion de la topographic qui resulte de {'assimilation de la lentillc symetrique a un solenoTde. Lc paramctre caractcristi- quc est; y > + 0,45Z)i + d\. de 0,15 dans les conditions donnees par la figure 7 (2). (c) La figure 7 donne egalement la condition que doit satisfaire la distance a partir de laquelle il est possible d"elargir le canal perce dans les pieces polaires, sans affecter la forme de la topographic (2). Expressions universelles dcs caracteristiqucs electro- optiqiics. — Les caracteristiqucs electro-optiques des lentilles ont ete calculees par differents auteurs (7, 8, 9). Les resultats de ces calculs sont donnes par des faisceaux de courbes assez mal commodes a consulter, aussi a-t-on cherche une representation unique d'utilisation aisee (10). Dans cet ordre d'idees nous avons propose des expressions universelles utilisant la notion de lentilles dans des etats d'excita- tion correspondants (3, 4). 8"lf»""' oinirnjjtf duchamp ma'' <*"""' Pi fcrr po/a I re f I ^r doi^'j 4 000 * 000 ttcilalion (IT) Fig. 6. Pour les excitations inferieures a 1000 S amperes- tours j'etaicmcnt de la topographic est invariahle. Pour les excitations superieures a 1000 5 il varie lineairemenl en fonc- tion de Texcitation. Fig. 7. Pour .\7 1000 .S' la topographic est de largeur mini- mum si : {a) a compris entre 55 et 65*^, {h) e prochc de £)/4, (c) 5i> Nil 500. Par aillcurs si ,\7 1000 .V il faut H>\/S' + D'; si Nr> 1000 S il faut r Ni-\ooosi Ces expressions sont fournies par le cas type du champ uniforme limite a rintervallc entre deux plans (fig. 8). Soit N i„ Texcitation pour laquelle la lentillc uti- lisee en projecteur fournit la longueur focale mini- mum /,„. Les caracteristiqucs electro-optiques prin- cipales ont alors les expressions suivantes, NI etant Texcitation de la lentillc. d")/,, longueur focale de la lentillc utilisee en projecteur 4 sin 2,03 sin 2,03 2,03 radians = 116. NI, NL Fig. 8. Trajectoire d'un electron dans un champ uniforme B limite a rintervallc entre les plans P„ et Z',. to J 8 Wo V* 58 P, DURANDEAU (2°) /„, longueur focale de la lentille utilisee en objectif ; (a) si NI<0,11 NIo, Jm Jrn sin 2,03 sin 2,03 -— — (/>) si NIOJINIq, /o sin 2,03 Nh Jm NI n7. (3°) z„, distance du foyer F„ au plan median (a) si NI<0J7 ^/q, z„ 1/1 A^/\ ^ = cotg 2.03 —- ; fm 0,55 2 ^ NlJ (h) si NI-OJl TV/q, ^n 1 /Jt 1 1^ /,„ 0,55 1 2 A^ 2 (4") C coefficient d'aberration chromatique (a) si NI<0J1 7V/o, Cc-^/ol 2,03 sin 2,03 ^— - cos 2,03 NI. NI n7. (/;) si A'/. 0,77 A^/„, Q. = 0,785/o. Pour le champ uniforme limite a Tintervalle entre deux plans : N!„ 10.01 V* et/,„ = 0.55 L. Ces expressions sent vakihlcs avec line approxima- tion inferieure a 5% dans tons les cas, a condition de donner a Nf„ et a /,„ les valeurs qui correspondent a la topographic fournic par la lentille donncc. Dans les cas usuels (0,5 < Dj S<2) on a : ^'/o=13,5l/V^ l/7^ /„,^ 0,5 KS2 + 0,451)2 La figure 9 donne, pour ces cas usuels, la valeur des rapports des caracteristiques electro-optiques au parametre \ S- + 0,45 D^. Pour la commodite prati- que il est preferable d'utiliser ce parametre plutot que/,,,. Z.i — H 1 L-. Ji'*0.t,i Di ; >. !■ ■ L 2 2.io L 5. SO . L ;1\ 4. Ic \ L 1 S ■\\ J. C^ \ 1 L ;^ yy 5 \ ^^*'^~ _.^^ \-^^ ^^\ '••'y- 5 c .1 1 ,5 ni Fig. 9. Variations du rapport des caracteristiques electro- optiques fondamentales au parametre de la lentille pour les cas usuels (0,5 < Z)/5< 2). La courbe de variation du coefficient d'aberration de sphericite C, est celle qui resulte de la reduction de la valeur de ce rapport calcule pour les cas usuels et non la valeur donnee pour le cas type du champ uniforme (5). En introduisant dans les expressions ci-dessus, le facteur d-elargissement 1 i m\,(Nl - 1000 5)/ 1000 5] faisant intervenir le degre de saturation des faces polaires on montre que la longueur focale /j est minimum pour un entrefer S calculable en fonction de D et de m (5). Conclusion. — Le probleme de la construction des lentilles electroniques magnetiques semble ainsi re- solu dans ses lignes essentielles pour toutes les ten- sions d'acceleration. BiBLIOGRAPHlE 1. DuRAND, E., Ann. phys. 12*^ serie. 10, Nov. Dec. 1954. 2. DuRANDEAU, P., J. plivs. icicliiini 1956, 17, 18 A. 3. — ibid. 1956, 17, 33 S. 4. — Conipt. rend. acad. sci. lAl, 1710 (1956). 5. — These a paraitre. 6. Hesse, M. B., Proc. Phys. Soc. B 63, 386 (1950). 7. Lenz, F., Z. angew. Phys. 2, 448 (1950). 8. — Optikl, 243 (1950). 9. LiEBMANN, G., Proc. Phys. Soc. B 68, 737 (1955). 10. LiEBMANN, G. and Grad, E. M., Proc. Phys. Soc. B 64, 956(1951). 11. MULVEY, T., Proc. Phys. Soc. B 64, 441 (1953). Ill ELECTRON-SPECIMEN INTERACTION Uber die Entstehung des Kontrastes im elektronenmikroskopischen Bild B. V. BORRIES t UND F. LeNZ Rheinisch- Westfdlisches Inst it ut fiir Obermikroskopie, Di'isseUhif, mid Inst it tit fiir Elektionenoptik unci Feinmechanik der Technischen Hochschule Aachen Ziisanvnenfassiini,'. — Es wild iiber neuere Fortschritte in den Vorsteliungen iiber die eiei is the electron energy in electron volts, and the scatter angle. It will he noted that the cross section is independent of atomic number. in the present experiments, the angular scatter measurements were made directly in the electron microscope. The arrangement was even simpler than that of Biberman et al. [2], who had to remove the projector polepieces and certain screens. The microscope was unmodified, except that the objec- tive was worked at long focal length (1 cm), and a small screening aperture immediately above the object was employed. The condenser lenses were switched off. so that a relatively low beam intensity was employed. This reduced the contamination rate of the specimen, and facilitated the timing of the exposures. The angular scattering distribution of the electrons after passing through the film under test was reproduced in the back focal plane of the objective lens. The projector lenses were used to project an enlarged image of this distribution onto the photographic plate. The photographic plates used (ilford Thin Film Half Tone) were known to have a linear density cur- rent density response over the range 0.2 to 1.0 blackening density, from the work of Digby, Firth and Hercock [4]. A series of exposures (covering the range 1-60 sec) enabled the whole scatter pattern to be recorded at densities falling between these limits. The incident electron intensity was found by allowing the beam to pass through a hole in the specimen, and by photographing the patch of illu- mination at a known instrumental magnification, it was then unnecessary to know the characteristics of the photographic material, as the scattered inten- sity could be related directly to the incident intensity in terms of the blackening density on the photo- graphic plate. The scatter patterns were analysed w ith a microphotometcr. In order to minimise the effect of contamination, a small screening aperture was placed immediately above the object, thus restricting the illumination to the area under observation. It was thus possible to search for a clean and undamaged portion of film without building up a layer of contamination on the specimen. The area of film from which the scatter was recorded was defined by an intermediate aper- ture of known size corresponding to an area of 5 sq. micron at the object. The first experiments were carried out with thin carbon films of known thickness [1]. By measuring the scatter intensity before and after a timed expo- sure to the electron beam, it was possible to calibrate the contamination rale under the conditions under which the film was being examined. This was found to agree very well with the figures given by Ennos a — .568204 Electron Mirroscopi/ ^6 M. E. MAINE AND A. W. AGAR ^1* xlO 300 1' 2 SO o 200 ISO -lOO so a o Id 2 ANGLE e 2x10 3xlO Fig. 1. Differential scattering cross section for carbon tilms of differing thickness. [5] and amounted to about 3 A min. Thus, except for the thinnest films, the scatter pattern could be recorded before the film thickness had changed appreciably. The angular distribution of scattered intensity as obtained from the blackening of the photographic plates was converted into the differential scattering cross section by dividing by the number of atoms per sq. cm of the scattering film, i.e. assuming single scattering conditions, which are the basis of the scattering theory. The additional scatter due to a thicker film should be exactly balanced by the dividing factor which includes the film thickness provided that the scat- tering mechanism remains unchanged. A series of carbon films of different thickness were analysed in this way, and the calculated differential scattering cross-section plotted in figure I . The dotted curve shows the theoretical curve, based on Lenz's expressions for elastic and inelastic scatter, the approximate expression (I) being used for calcula- tion of the inelastic cross section. It will be seen that, while the results agree within a factor of 2 with the theoretically predicted ones, the curves do not lie on top of one another, but show a definite gradation with the film thickness employed. The difference between the curves is too great to be ascribed to faulty measurement of film thickness or incorrect contamination rate (the results for the thinner films have been corrected for the measured contamina- tion rate). The "reference thickness'" or "transparency thick- ness" defined by von Borries as the thickness of film in which every incident electron is, on the average, scattered once elastically, is about 450 A for carbon, it might be expected that carbon films thinner than this would give similar results for scattering cross section. Since they do not, it suggests that, at each thickness, there is a rather higher pro- portion of electrons scattered outside the effective aperture than is allowed for in the theory. Since the inelastic cross section was expected to be xlO 300 1 2SO 1 .---' ( 1 ) Theorciicol 'Elastic + Inelastic) (Atler Ltnz} ( 2j Silver 60A. ' Correciid tor Carbon Film ) ■o|-D 200 IV'^ (3) Carbon 55 A. ( Corrislriciun!^ der gestreiilen Elcktroncn. — Fur die Registrierung der Streuelektronen wurden photo- graphische Flatten benutzt. Die photographische Methode hat gegeniiber der direkten Strommessung mit einem Faraday-Kiitig den Vorteil, daB sie eine genauere Ausmessung der Stromdichten gestattet, als es mit dem Faraday-Kiifig moglich ist, da dieser aus Empfindlichkeitsgrunden eine mehrere Quadratmilli- meter groBc OfTnung haben mUBte. Weitcrhin kon- nen auch sehr kleine Intensitiiten durch lange Belich- tungszeiten noch registriert werden. SchlieBlich wer- den alle Streuwinkel gleichzeitig aufgenommen, wo- durch auch bei Stromiindcrungen wiihrend der Be- lichtung die relative Stromdichtevertcilung die glei- engster Strahlquerschnitt Obiektblende a ("+/') Blendenradius Abb. 4: Zur Bcrechnung des Radius der Primarstrahlspur im Abstand a von der Blende. 70 G, KEMPF UND F, LENZ che bleibt. Ein Nachteil besteht darin, daB die Stromdichten auf dem Umweg iiber die Platten- schwarzung erhalten werden, wodurch eine zusatz- liche Fehlermoglichkeit entsteht. Als Aufnahmematerial wurde die Perutz-Silber- eosinplatte wegen ihrer giinstigen Empfindlichkeit verwendet. Ihre Gradationskurve hat eine mittlere Steilheit; einerseits ist sie flach genug, daB bei einem Belichtungsintervall von einer Zehnerpotenz die Schwarzungen in einem bequem auszumessenden Bereich lagen, andererseits aber auch steil genug, um kleine Belichtungsunterschiede noch geniigend deut- lich wiederzugeben. Die Aufnahme der Gradationskurve geschah durch stufenweise Belichtung einer Platte im Elek- tronenmikroskop. Durch einen verstellbaren An- schlag fiJr die Transportkurbel fiir die Plattenkasset- ten wurde der Kassettendeckel wahrend der Bestrah- lung stufenweise geoffnet und so auf der Platte Streifen bei der gleichen Bestrahlungsintensitat niit verschiedenen Zeiten belichtet. Die gleichmiiBige Stromdichteverteilung in der Registrierebene wurde durch Starke VergroBerung des Strahlquerschnitts mittels der Elektronenlinsen hergestellt. Die Platten wurden dann zu je 12 Stuck in einem Plattenkorb in jeweils frisch angesetztem Agfa-Methol-Hydrochinon in der Verdiinnung 1 : 10 bei 20 C 10 Minuten lang unter standiger Bewegung entwickelt. Die Tempera- tur schwankte nicht mehr als ±0,1 C. Die jeweils gleiche Entwicklerkonzentration wurde durch ge- naues Abmessen des konzentrierten Entwicklers und des Wassers zur Verdiinnung eingehalten. Das absolute MaB der Stromdichte, mit der die Stufenkeile belichtet wurden, wurde nicht ermittelt, da bei den Streuexperimenten der Primarstrom nicht gemessen werden konnte, sodaB nur die relative Ver- teilung der Streuintensitaten auf die verschiedenen Winkel bestimmt werden konnte. Darum kam es auch bei der Gradationskurve nur auf die Kenntnis des relativen MaBes der Bestrahlung an. Fiir die Streuaufnahmen wurden eine groBere Menge der Platten derjenigen Emuisionsnummer. auf die die Stufenkeile fiir die Gradationsbestim- mung aufgenommen worden waren, aufbewahrt. Spiiter stellte sich heraus, daB wahrend der Lagerung die Gradation der Platten mit der Zeit erheblich llacher und der Schleier starker wurde. Es wurden deshalb fur die Streuaufnahmen immer frische Plat- ten verwendet und bei der Entwicklung zusammen mit diesen jeweils einige neu aufgenommene Stufen- keile mitentwickelt. Ein Nachteil dabei war, daB je- weils nur wenige Stufenkeile neben den Streuaufnah- men in einem Plattenkorb Platz hatten und die GroBe des Entwicklungstanks im Hinblick auf einen nicht zu groBen Entwicklerverbrauch nur als aus- reichend fiir einen Plattenkorb gewiihlt war. Es konnte daher aus den wenigen, meist etwas vonein- ander abweichenden Schwarzungen der Stufenkeile die Gradationskurve nur entsprechend weniger genau ermittelt werden. Aufnahme der Streuverteilung. — Die Streuintensi- taten in dem zu untersuchenden Winkelbereichgehen uber etwa vier Zehnerpotenzen. Da auf einer Platte nur ein Intensitatsumfang von wenig mehr als einer Zehnerpotenz mit geniigend groBer Genauigkeit aus- gemessen werden konnte, wurde der gesamte Win- kelbereich in vier Tntervalle aufgeteilt, die mit verschiedener ProjektivvergroBerung aufgenommen wurden. Die Belichtungszeiten wurden so gewahlt, daB der giinstigste Schwiirzungsbereich {S =0,1 bis 1 ) auf der Platte in dem betreffenden Winkelintervall lag. Meist wurden bei derselben ProjektivvergroBe- rung zwei Aufnahmen mit verschiedenen Belich- tungszeiten gemacht, damit die Einzelkurven sich iiberlappten. Das gute Zusammenpassen der Einzel- kurven ist ein Kriterium einerseits fiir die Konstanz des Strahlstroms, andererseits fiir die Richtigkeit der verwendeten Gradationskurve. Das Auseinander- klatTen in immer der gleichen Richtung bei den Einzelkurven der ersten ausgewerteten Streuauf- nahme war der AnlaB zur Nachprufung der Grada- tionskurve und fiihrte zur Entdeckung der Grada- tionsvertlachung bei den lange aufbewahrten Platten. Die gleiche Streuaufnahme mit Hilfe der berichtigten Gradationskurve ausgewertet lieferte die sehr gut zusammenpassenden Kurven der Abb. 5. Die Be- lichtung erfolgte nach einer Stoppuhr durch Auf- und Zuklappen des den Leuchtschirm tragenden Deckels der Plattenkamera. Bei den angewandten Belichtungszeiten zwischen 2 und 30 Sekunden konnte die Belichtung mit geniigender Zeitgenauig- keit mit der Hand vorgenommen werden. Die genaue Kenntnis der Belichtungszeit und der Projektivver- groBerung war fiir die Umrechnung der gemessenen Plattenschwarzungen in die relativ zu den unver- groBerten Aufnahmen richtigen Stromdichten wich- tig. Die absoluten Streustromdichten sind bei einer bestimmten Folic proportional zum Primarstrahl- strom. Eine Kenntnis der Absolutwerte der Streu- intensitiit ist also nur dann von Wert, wenn auch der Primiirstrahlstrom gemessen werden kann. Bei dem verwendeten Elektronenmikroskop war dies aber nicht moglich, well bei eingeschaltetem Strahl die Streufolie nicht gegen eine leere Blende ausgewech- selt werden konnte. um den durch Streuung nicht geschwiichten Strahl aufnehmen zu konnen, und weil nach dem Aus- und Wiedereinschalten der Kathodenheizung der Strahlstrom im allgemeinen einen anderen Wert annimmt (die GroBenordnung des Strahlstroms war 10"'^ A). Die an die Streukur- ven geschriebenen Absolutwerte der Stromdichte im Verhiiltnis zum Primarstrahlstrom wurden der Theo- rie von Lenz [7] entnommen, was insofern berechtigt erschien. als die Form der Streukurven sehr gut mit der nach der genannten Theorie berechneten Kur- venform iibereinstimmte. Jeweils unmittelbar vor der betreffenden Einzelauf- nahme mit einem bestimmten Projektivpolschuh wurde die ProjektivvergroBerung bestimmt. Streuung von 70-kV-Elcktronen an Kohlenstoff 11 Wr \ -la - t s 2 10 5 2 S 2 n s • • < • • « « \ » a • • •(1 a • e 2 nl 5 2 1 e p-OOJ *» « V 1 -i." ro' 2 5 W' 2 5 W' 2 5 '0 ' /O' ^ 5 W' 2 to s 2 , i6 \ 1 c • ■» • « • • /D 1 5 • 2 It tS 5 2 iS 5 2 m « \ P'0.2 e e > j^ tO'r Abb. 5. 2 4 2 4 ra Abb. 6. I0-' 2 5 to-' 10-' 2 P'QSS JO-' 2 Abb. 7. 5 to- to- Abb. 5-7: Kurven der Streuverteilung von Kohlenstoff verschiedener Massendickc. Die durch unterschiedliche Zeichen ( 0) dargestellten MeBpunkte vvurden von verschiedencn Flatten der betieffenden Aufnahmeseric gewonnen. A',, ist die Anzahl der die Folic trefienden Elektronen, dN die Anzahl der in das Raumwinkelelement dil gestrcuten Elcktronen. Diskiission der Experimentalergebnisse. — Die Ab- bildungen 5 bis 7 zeigen die Kohlenstoff-Streuver- teilung bei verschiedenen Foliendicken. Etwa bei 1) = 10 - tritt der erste Beugungsring auf. Das ent- spricht einem Atomabstand von 4 bis 5 A. Infolge des logarithmischen AbszissenmaBstabes liegen die folgenden Beugungsringe dicht hintcr dem ersten Lind lassen die Streuverteilung im Bereich Si ■ 10"- nicht mehr gut erkennen. Dagegen sind die Streu- kurven im Winkelbereich zwischen 10^ und 10 - ungestort und die MeBpunkte liegen hier recht genau auf einer Geraden. deren Steigung von der Massen- dicke abhiingt. Die Massendicke yl wird zweck- miiBig in Einheiten der Aufhellungsdicke -//' gemes- sen; fur Kohlenstoff betragt deren Wert nach Lenz [7] etwa y/' = 2,51 10 10 ViX+eUjlm^c^) g (\ +e UjmQ c')'~ V cm- fur U 70 kV also etwa yl' = 1,46 10-= gcm-2. (2) (3) In der Theorie [5] wird fur p -'Z'2 (p = yl/yl' = Verhiiltnis von Massendicke zur Aufhellungsdicke) der Ausdruck fiir die Streuelektronendichte in zwei Summanden aufgespaltcn, von denen ciner zu 'd ^ proportional ist und fiir If 10 - groB gegen den anderen Summanden ist, so daB er nur allein beriicksichtigt zu werdcn braucht. Wegen der reinen Potenzabhiingigkeit von /> ist die theoretischc Streukurve im doppelt logarithmischen Koordina- tensystem ebenfalls eine Gerade. Ihre Steigung be- triigt 4p Z 2, ist also eine lineare Funktion von/?. In Abb. 8 ist diese Funktion fiir Z 6 dargcstellt und dazu die Werte, die sich aus den experimentellcn Kurven ergeben. Wie man sieht, liegen die MeBwerte bei den Folien mit glatter Oberfliiche in der Nahe der theoretischen Werte. Die Punkte, die zu den Folien mit weniger ebener Oberilache gehoren, liegen hoher. Es ist anzunehmen, daB die unebenc Ober- flache ihre Ursache darin hat, daB durch zu schnelle Verdunstung des Losungsmittels Blasen in der Folie enstanden sind, wodurch dann die Massendicke ge- ringer ist, als es sich aus der Dickenmcssung ergab. Die hoher liegenden Werte der Abb. 8 konncn hier- durch erkliirt werden. Bei Winkcln 'V 3 10 ' werden die Strctikiirvcn • c 2 t !5 O ^N* « 1.7 X te . o J5 K O V \ 1000 2000 3000 4000 5000/ — d 0. 1 Q? QJ 0,< P5 t — P Abb. 8: Abhangigkeit der Steigung der Strcukurven der Abbiidungen 5 bis 7 und zwei weiterer von der Massendicke /; bzvv. Foiiendicke J nach Theorie ( ) und Experimentcn mit den Folien mit ebener ( ) und unebener( ) Oberfiache. 72 G. KEMPF UND F. LENZ nach min nach 2 mm nach 6 mm 10- 5 2 I 10- 5 10- 5 2 10- 5 10- 5 2 10 5 \ \, \ ±^ 5 10-' 2 \ ^ k \ \ ■J 1 — ^ 5 10-' 2 \ X \ \ ; _ ^ T 2 10-' 2 \ \ J L nach 16 mm 10- 10-' 2 Abb. 9: Streukurven nach verschiedenen Bestrahlungszeiten einer 1400 A dicken Folie. Steigung der Kurven: a) 1,5, b) 1,71, c) 1,76, d) 1,8, e) 1,8, f) 1,8. flacher. Diese Tatsache folgt auch aus der Theorie fiir die Einfachstreuung (vergl. Abb. 6 aus [7]); aus der in [7] durchgefuhrten Theorie der Mehrfachstreu- ung geht sie nicht hervor. Das liegt daran, daB dort fiir den unelastischen differentiellen Streuquerschnitt auf eine Beriicksichtigung von dessen endlichen Grenzwert fur fZ-^O zur Vereinfachung der Rech- nung verzichtet wurde, was sich bei der Streuver- teilung von 70-kV-Elektronen fur Streuwinkel & < \0'* bemerkbar macht. Bei Abbildung 6 kann man bei *^ < 1,5 >■ 10"* den iJbergang der Streustromdichte in den ungestreuten Anted des Primiirstrahls beobachten. Eine mogliche Fehlerquelle bei der Bestimmung der Massendicke ist das Aufwachsen einer Koh- lenstoffschicht bei der Bestrahlung im stets etwas kohlenwasserstoffhaltigen Vakuuni des Elektronen- mikroskops. Abbildung 9 zeigt, daB nach 1 6 Minuten langer Bestrahlung die massendickenabhangige Stel- es OS — » t {minj Abb. 10: Anderung der Steigung der Kurven der Abbildung 9 in Abhangigkeit von der Bestrahlungszeit. Da die Belich- tungszeit jeweils 30 Sekunden betrug, liegen die MeBpunkte 15 Sekunden hinter der auf Abbildung 12 in vollen Minuten angegebenen Zeit, die den Beginn der Belichtung angibt. gung der Kurven im Winkelbereich zwischen 10"* und 10~^ keine merkliche Anderung erfahrt, daB bei den vorliegenden Versuchsbedingungen eine merk- liche Zunahme der Massendicke durch Aufwachsen einer Kohlenstoffschicht also nur sehr langsam er- folgt. Die Abnahme der Massendicke zu Beginn der Bestrahlung ist durch das Abdampfen der Nicht- Kohlenstoff-Atomgruppen verursacht (vergl. Abb. 10), wie eben bereits erwahnt wurde. Fiir die Themenstellung, sein standiges Interesse und zahlieiche Diskussionen sind wir unserem kurz nach Fertigstellung der vorliegenden Arbeit verstorbenen Lehrer, Herrn Prof. Dr.-Ing. Bodo von Borries zu tiefem Dank verpflichtet. Bei der Durchfiihrung der Experi- mente hat uns ferner Herr Dipl.-Phys. W. Scheffels manchen wertvoUen Hinweis gegeben. LiTERATUR 1. BiBERMANN, L. M., Izvest. Akad. Nauk SSSR, Ser. Fiz., 15,429 (1951). 2. BiBERMANN, L. M., Wtorow, E. N., Kowner, I. A., SsuscHKiN, N. G., und Jaworsku, B. M., Coinpt. rend. acad. sci. URSS 69, 519 (1949). 3. BOERSCH, H.,Z. Natiirforsch. 2a, 615 (1947). 4. VON BoRRiES, B.,Z. Naturforsch. 4a, 51 (1943). 5. Brockes, a., Vortrag gehalten auf der 6. Tagung der Deutschen Gesellschaft fiir Elektronenmikroskopie in Miinster 1955. 6. KoNiG, H.,Z. Physik 129, 483 (1951). 7. Lenz, F.,Z. Naturforsch. 9a, 185 (1954). 8. ToLANSKY, S., Multiple-Beam Interferometry of Surfaces and Films. Oxford, 1948. 9. Weber, K. und von Fragstein, C, Optik 11,511 (1954). Experimentelle Untersuchungen zum Kontrast cUinner Schichten im Elektronenmikroskop W. LlPPERT Max-Planck-Institut fiir Biophysik, Frankfurt a. M. Die elektronenmikroskopische Durchlassigkcil diin- ner Schichten ist sowohl von dor theoretischen als auch von der praktischen Seite von gewissem In- teresse. Neuere theoretische Untersuchungen von Lenz (3) haben iiltere Ergebnisse (1,2) modifiziert, und es erscheint zweckmiiBig einmal zu priifen, inwie- wcit diese Theorien die Verhiihnisse bei praktisch vorkommenden Schichten wiedergeben. Zum an- deren besteht immer wieder einmal der Wunsch, aus der eiektronenmikroskopischen Durchliissigkeit Riickschliasse auf die Schicht- bzw. Massendicke zu Ziehen. Das Ziel der Untersuchungen war also festzustel- len, ob bei einigermaBen detinierten Schichten eine eindeutige Beziehung zwischen Schichtdicke und elektronenmikroskopischer Durchliissigkeit, die na- tiirlich noch von der Objektivapertur und der Strahlspannung abhiingt, besteht. Ferner sollte ge- priift werden, ob die MeBresultate den theoretischen Berechnungen folgen. Wenn auch die Zielsetzung der Untersuchungen sehr klar war, darf doch nicht verschwiegen werden, daB sowohl bei der experi- mentellen Durchfiihrung, als auch bei dem Vergleich der Messungen mit der Theorie eine Reihe von prin- zipiellen Schwierigkeiten zu diskutieren war, auf die hier aber leider nicht niiher eingegangen werden kann. Es ist aber z. B. offensichtlich, daB man keine strenge Ubereinstimmung erwarten darf, da die hier in Frage kommenden theoretischen Ansatze die Struktur der Materie nicht beriicksichtigen, sondern sich strenggenommen nur auf einzelne Atome be- ziehen. Die MeBmethode war kurz folgende: An einem mit Zwischenhnse versehenen Siemens-Mikroskop wurde die photographische Platte durch einen Auffanger fiir Elektronen ersetzt. Die Objektivaper- tur wurde — vor allem zum Vergleich mit der Theorie — ungefiihr in dem Bereich zwischen I 10- und 9 X 10^- veriindert. Die benutzten Spannungen wa- ren 50 und 1 10 kV. Die Zwischenhnse gestattete die einwandfreie Justierung des Eiektronenstrahls und die durch die Kontrastblende eingestellte Objektiv- apertur zu kontrollieren. Bezijglich der untersuchten Schichten bestand die Absicht, amorphc und kristalline und auch leicht- und schweratomige Schichten zu untersuchen. Ge- nauere Messungen wurden an Kohle-, Aluminium-, Palladium- und Wolframoxydschichten durchge- fiihrt. Die Kohleschichten wurden dabci nach dem Konigschen Verfahren in einer Giimmentladung in Benzoldampf hergestellt. Die ubrigen Schichten wa- ren Aufdampfschichten. Der Auffanger fijr die Elek- tronen war so dimensionicrt, daB bei kristaliinen Schichten iiber eine groBe Zahl von Kristallitcn gc- mitteit wurde. Bei dem Vergleich mil der Theorie haben wir uns bei den relativ groBen Aperturen darauf beschriinkt, die elastische Streuung zu beriicksichtigen. Benutzt man die Wcntzclsche Streuformel (1927), so liiBt sich die eiektronenoptische Durchliissigkeit in allgc- meiner Form als Funktion einer zuniichst noch un- bestimmten Dicke — wir haben dazu die Aufhcl- lungsdicke gcwiihlt — und eincs ebenfalls zuniichst noch unbestimmten Winkels angeben. Mathematisch ergibt sich folgender Ausdruck: D{y,p) = exp 71 p\ 1 + ~yHY>(iy) 'D, hy 7 d{y do) Dabei ist }' die durch die Kontrastblende bedingte Ob- jektivapertur p die relative Massendicke der Schicht. ausge- drtickt in Vielfachen der von v. Borries (1951) eingefiihrten Aufhellungsdickc do die Winkclkonstante der Wentzelschen Streuformel /i, H'l^ die Besselsche bzw. Hankelsche Z\linder- funktion. Die Ausvvertung der Formel zeigt Bild 1: Die Kurven zeigen den Verlauf der eiektronenmikro- skopischen Durchliissigkeit als Funktion der Aper- tur fiir konstantc Dicke. Um diese Kurven mit den Experimenten in Beziehung setzen zu konnen. ist es notwendig, numcrische Werie fiir Aufhellungsdicke und Winkclkonstante anzunchmen. Um einen Uber- Abb. I. 1 Ickironcnmikroskopischc Durciiiassigkeit als Funk- tion tier ApcrUir tiir konstantc Dicke. 74 W. LIPPERT Tabelle I. Aiifhellungsdickcn in tig cm /^.„2 C Al Pd W 50 kV 9,1 7,3 5,4 4,9 (v. Borries) 21,4 17,4 12,6 11,5 (Leisegang) 11 10.5 10 10 (Lenz) 110 kV 17,2 13,8 10,2 9,2 (v. Borries) 40,8 32,6 24,1 21,9 (Leisegang) 20 19,5 19 19 (Lenz) blick iiber die in der Literatur benutzten Werte zu geben, haben wir die fUr die durchgemessenen Sub- stanzen in Frage kommenden Aufhellungsdicken nach drei verschiedenen Arbeiten, der Arbeit von V. Borries (1), der von Leisegang (2) und der von Lenz (3) berechnet. Wiihrend v. Borries und Leisegang fiir die Auf- hellungsdicken Formeln benutzen, die aus der Moliereschen Theorie abgeleitet sind und von der Ordnungszahl abhangen, berechnet Lenz mit Hilfe von Hartreefeldern die Aufhellungsdicken nur fur einige Substanzen. Die in der Tabelle nach Lenz angegebenen Werte fiir Al, Pd und W sind inter- poliert. Eine solche Interpolation ist nicht ohne weiteres zu rechtfertigen. Wir haben es trotzdem ge- tan, urn die Lenzschen Rechnungen mit fur die Diskussion benutzen zu konnen. Fur die Berechnung von <)„ wird meistens eine Formel der Art Zi In- a benutzt. X ist dabei die Wellenlange, Z die Ordnungs- zahl. a bedeutet bei einigen Autoren die Thomas- Fermi-Lange fiir WasserstoflF, bei anderen den Bohrsche Wasserstoffradius. Da der Unterschied bei- der Werte nur 11,4 ','„ betriigt, scheint zum Zvvecke des Verglcichs mit den vorliegenden Messungen eine niihere Diskussion nicht notwendig. Wir be- nutzen als Vergleichswert fur f\, denjenigen Wert, der sich durch Benutzung des Bohrschen Radius ergibt. Resultate: Es sollen zunachst die MeBresultate fiir Kohle, und zwar fiir die beiden Spannungen 50 und 110 kV diskutiert werden: Auf der Abszisse der Abb. la und lb ist dabei die Apertur, auf der Tabelle 2. Winkelkonstanten fiir die unicrsuchtcn Substanzen. Al Pd W 50 kV 110 kV 0,029 0,019 0,038 0,025 0,057 0,038 0,067 0,044 Ordinate die „Durchlassigkeit" angegeben. Die aus der Theorie erhaltenen Kurven sind ausgezogen, die mit Kreuzen gekennzeichneten MeBpunkte durch gestrichelte Geraden verbunden. Die an die Kurven geschriebenen Zahlen geben die Massendicke in //g cm- an. Als theoretischc Werte haben wir hier die Zahlen nach Lenz benutzt. Man sieht, daB die MeBpunkte einigermaBen die von der Theorie ver- langte Abhiingigkeit von der Apertur wiedergeben. Abweichungen lassen sich meistens durch Ringe im Beugungsdiagramm erkliiren. Keine tJbereinstim- mung besteht aber zwischen den gemessenen und den nach Lenz errechneten Massendicken. Die expe- rimentellen Massendicken sind bei 50 kV etwa 1,7- bis l,8mal, bei 110 kV etwa 1,8- bis l,9mal so groB wie die errechneten. Ahnlich sind die Resuhate bei Aluminium (Abb. 2c): Die Aperturabhiingigkeit wird, eventuell unter Berucksichtigung der UnregelmiiBigkeiten im Beu- gungsspektrum, einigermaBen befriedigend wieder- gegeben, die experimentelle Massendicke ist aber etwa um den Faktor 1,4 bis 1,5 groBer als die aus der Theorie interpolierten Werte. Mg-F.,, von dem wir auch einige Proben vermessen haben, verlangt etwa das l,6fache der errechneten Massendicke. Bei den schweratomigeren Substanzen sieht es bei Pd (Abb. 2d) zunachst so aus, als ob eine relativ befriedigende Ubereinstimmung zwischen Experi- ment und Rechnung sowohl bezuglich der Winkel- abhiingigkeit als auch bezuglich der Massendicke vorliegt. Doch ist auch hier schon das angedeutet, was bei Wolframoxyd (Abb. 2e) deutlich sichtbar wird: Der Verlauf der errechneten Kurven wiirde sich besser dem Experiment anpassen, wenn der Ver- lauf steiler, d. h. die Winkelkonstante kleiner ware. Die Vergleichskurven fiir Wolframoxyd beziehen sich auf reines Wolfram. Der Gewichtsanteil des SauerstofTs betriigt bei dem in die Verdampfungs- apparatur gebrachten WO.j nur etwa 20 "„. Da bei der Verdampfung eine Reduktion stattfindet, diirfte bei der eigentlichen Schicht der Sauerstoffgewichts- anteil noch kleiner sein. Auch wenn man z. B. ver- sucht, die Wolframoxydschicht als aufeinanderlie- gende Schicht von W und O aufzufassen, bleibt diese charakteristische Abweichung im Prinzip beste- hen. Auch bei Wismut- und Platinschichten zeigte sich ein ahnlicher Effekt. Die Winkelkonstante sollte bei beiden Substanzen etwa um 40 "o kleiner sein. Die Messungen haben als wichtiges Resultat ge- zeigt, daB bei den bisher genannten Substanzen eine eindeutige Beziehung zwischen elektronenmikro- skopischer Durchliissigkeit und Schichtdicke, die i. a. recht gut durch eine t'-Funktion wiedergegeben wird. besteht. Abb. 3 zeigt als Beispiel hierfiir die Abhiin- gigkeit der Durchlassigkeit von der Schichtdicke fiir Kohle bei 50 kV und einer Apertur von 0,03. Aller- dings gibt es auch Schichten, fiir die diese einfachen und reproduzierbaren Verhiiltnisse nicht zutrefFen. Dies ist der Fall bei Substanzen, bei denen die Kontrast diinner Schichtcn im Elcktionenmikroskop 75 100 Kohle. 50 KV ___— — ^^^ — —' ' ^ — D ^^^^^^^ ^<^^^^'^ ^^-— 5.5 ^<^^ ^ J 50 — \^ 1 1 1- 1 1 1 — 1 100 001 0.02 003 0.04 0,05 0.06 0.07 08 ;• Kohle, 110 KV ^^-^-HT" _^^r-^ . ^^^^5^^^ ^^,^=.^:S— - ^^^ /y>:^'' ^^55?-=*'''''^^ ^___„,„-— ^^"-. ^^..--''"''''^ / .^^■^^'^ ^^„--- "^ py ^^-^ / / 20^' 8^ y ■^ ^^ 422 y ^^ ' y^ y^ y^ y^ yT^ ^ ^ 40,^/ y t=- 1 1— 1 \ H 1 1 1 0.01 0.02 0.03 004 005 006 0.07 0.08 la lb uo Al. 50 KV - u ^-—-""'^ — " " _J^ — "^^ — "- " " ^ --^ ** ^'""'^'^ — ' "^ -^ 3?^ ^^^-^^^ " .j!>^C^' ^ ^^^^J^^^^"^^^ ^ ' sn- je" ^.-'"■^'''^ -^ ** --^ '^(C — ^.^-^"^^^ "^ tr-^"""''^ -^ *''^ -^ '^ ^-^"""'''^ ^- "^ lii^^ltv'-/ C^ -^^^ - " ^^^^^ "^ vi.T^'^-y^ *" ^^^-"^^^ ^^^"""^^^ ^ ^-^"^^^^ _y__-— — 3^ -' ^^--""^ "^ ^---^'^ i2 __ — — -^ 1 p 1 1 1 1 1 1 ' 0,01 0,02 03 0.04 0.05 0.06 07 08 100 Pd 50 KV ^^__^ u 5 —- -— "^ ^ -.y^^^^^^^ — >fr^ — j<^ ^-— — "^ — ^ -— • "^ 10 ^ -"^^ ^ €^'\^^^^ 20 ^ ^ ^ -— ^ — - — »- 22 •*'^ -- " ^ _- — " 40 — 1 1 — — 1 \ 1 1 1 1 0.01 02 03 04 0.05 06 07 08 ,• Ic Id Abb. 2 a-e. Die Durchlassigkeit als Funktion der Apertur bei verschiedenen Massendicken in //g/cm- angegeben. Aus- gezogene Kurven aus der Theorie eriialten; gestrichelte Kiir- ven durch die MeBpunkte gezogen. Massendicke im Sublichtmikroskopischen sehr un- gleichmaBig ist wie z. B. bei Gold und Silber. Das Elektronenmikroskop liiBt sich also bei Sub- stanzen mit einigermaBen gleichmaBiger Schicht- dicke nach Eichung zur Dickenmessung benutzen. Der MeBbereich laBt sich dabei durch Verandcriing der Objektivapertur in gewissen Grenzen verandern. Leider laBt sich aber die Abhiingigkeit der Durch- I'l <^<^' lUU D Wolfram oxyd, 50 KV 50' 10 20 igiSSS^: 40 -T — '"'^ i"^ 1 1 1 1 1 ' 03 005 07 le Abb. 3. Die Abhangigkeil der Durciiiassigkeit von der Schichtdicke fur Kohle bei 50 kV, Apertur 0,03. liissigkeit von der Schichtdicke nicht ohne weiteres aus dem hier benutzten cint'achcn Ansatz und den in der Literatur bekannt gewordenen Berechnungen entnehmen. Die Abweichungen hegen bei den leicht- atomigen Elementen in der Richtung. daB die Lcnz- schen Werte I'iir die Aufhellungsdicke zu kiein sind, man muB vielmehr fiir die Auliielkingsdicke Zahicn einsetzen, die in der Niihe der Leisegangschcn Werte liegen. Bei den schweratomigen Elementen lassen sich die Abv\eichungen in erster Linic so deuten, daB man fiir die Winkelkonstante gegeniiber dem theoretischen Wert einen kleineren Wert cinzusetzen hat, um /u einer besseren Angleichung der Mes- sungen an die Theorie zu kommen. Literatur 1. VON BoRRiES, B.,Z. Naturforsch. 6a, 51 (1951). 2. Leisegang,S.,Z. Physik 132, 183 (1952). 3. Lenz, F.,Z. Naturforsch. 9a, 185 (1954). 4. Wentzel, G., Z. Physik 40, 590 (1927). Zur Veranderung des Streuvermogens eines Festkorpers gegentiber mittelschnellen Elektronen infolge lonisation und Anregung W. SCHEFFELS Rheinisch- Westfdlisches Institiit fiir Vbennikroskopie, Diissekhif Die friiher beschriebenen Versuche mit diinnen Fo- lien im Schattenbildstrahlengang (7, 8, 9) wurden fortgefiihrt in dem Bestreben, quantitative Ergeb- nisse zu erhalten iiber die Anderung des Streuver- mogens durch die Bestrahlungsstromdichte. Zu- nachst soil kurz der Strahlengang in dem benutzten permanentmagnetischen Elektronenmikroskop nach von Borries (2) geschildert werden (Abb. 1). Der etwa 4 10"^ cm im Durchmesser groBe engste Strahlqucrschnitt des Strahlerzeugers (a) wird mit der Projektivlinse (h) und weiter mit der Objektiv- linse (c) auf beispielsweise 6 10 '^ cm verkleinert. So ensteht hinter dem Objektiv eine scharfe Kaustik, die lediglich iiber den Durchmesser des verkleinerten Bildes der Strahlquelle verschmiert ist. Befindet sich eine diinne Folic zwischen Objektivlinse und hinterer Brennebene, so schneidet sic die Kaustik, und in- folge der erhohten Stromdichte in den Schnittlinien (Kaustikstern und Kaustikmantel) lassen sich diese mittcls KohlenstofTauftragung auf die Folic auf- zeichnen. Im Schattenbild kann man diese aufwachsenden Kohlelinien gleichzeitig beobachten (Abb. 2a). Die achsennahen Strahlen projizieren den Kaustikstern in die Mitte des Bildes, aber die Strahlen, die in der Folienebene zum Aufbau des Kohlesterns beitragen, projizieren ihn ebenfalls weiter auBen im Bild. Der Kaustikmantel wird scharf nach ganz auBen proji- ziert. Eine Theorie dieser Schattenprojektion von F. Lenz (4) ermoglicht eine quantitative Deutung dieser Aufnahmen. Wartet man mit der Aufnahme des Schattenbildes aber nicht bis sich die Kohle aufgetragen hat, oder bewegt man gar die Folic wahrend der Aufnahme mit der Objektverstellung in der Folienebene, so erhiilt man ebenfalls eine Projektion von Linien, wie Leuchischirm in Abb. 2h auf einer Kollodiumfolie. Die mittelste Figur wurde friiher als ,,Streustern" beschrieben. Im Gegensatz zu der Kohleauftragung ist die Anderung des Kontrastes der Kollodiumfolie vollig reversibel und hat seine Ursache nur in der erhohten Strom- dichte in der Kaustik und nicht in einer Anderung der Massendicke der Folic. Bemerkenswert sind die hellen Siiume an der Seite der dunklen Linien. Sic lassen sich als Beugungssaume erklaren, wenn man annimmt, dass in der Objektfolie an dieser Stelle eine sprunghafte Anderung der elektronenoptischen Brechungsindex oder des Absorptionskoeffizienten stattfindet. Wie man auf der gerechneten Darstellung (Abb. 3) der Stromdichte im Kaustikquerschnitt auf einer Geraden durch die Taille des Sterns sieht, fiillt die Stromdichte sowohl im Stern wie im Mantel nach auBen viel schrofTer ab als nach innen. Bei einer idealen Kaustik d. h. bei Verwendung einer punkt- formigen Elektronenquelle, wiirde die Stromdichte unendlich werden, aber da diese iiber das verkleinerte Bild der Strahlquelle verschmiert ist, erhalt man durch Mitteilung endliche Maxima in Stern und Mantel (beispielsweise 5 10"- A cm- in der Sterntaille). Man kann annehmen, daB infolge der stark unter- schiedlichen Stromdichte auf der Fclieauchdielonisa- tion und Anregung der Objektatome und damit das mittlere innere Potential in der Folic ortlich stark ver- schieden ist. Rechnet man fiir eine Abschiitzung bei einem scharfen Sprung zwischen zwei konstanten Werten des inneren Potentials die Intensitaten der in der Schattenprojektion enstehenden Fresnelschen Beugungslinien aus und mittelt diese Intensitatsvcr- teilung iiber den Durchmesser des Bildes der Strahl- quelle, so erhalt man — als Phasenkontrast — eine Intensitatsverteilung, wie sie bei den in Abb. lb gezeigten dunklen Linien mit hellem Saum vorliegt. Vergleicht man diese gerechnete Verteilung der a "1 Abb. 1. Registrierung der Kaustikquerschnitte. Abb. la. Schattenbild eines Kaustii:5.J ro'cm d) nur axenparallele Strohlen Abb. 5. Stromdichten auf dem Kaustikquerschnitt in Ab- hangigkeit von dessen axialer Lage — Z = z/C^. y\ = Strom- dichte im Kaustikquerschnitt, /,,- Stromdichte in der Mitte der Linse. inneren Potentials, wie sie hier durch Tonisation und Anregung der Objektatome hervorgerufen wird, ist also verbunden mit einer Anderung der Streuquer- schnitte. Der Zusammenhang zwischen der Anderung des inneren Potentials und der Stromdichte auf der Folic liiBt sich qualitativ in folgcnder Weise bc- schrciben (5): Die Bcrechnung des inneren Potentials aus nach H. Bethe (1) gilt nur. wenn der Fest- korper aus einander gleichen, kugelsymmctrischcn Atomen besteht, was hier nicht der Fall ist, da in der Folic infolge unelastischer Strcuung ein Teil der Atome ionisiert oder angercgt ist. Wenn der Fest- korper aber im Ganzen neutral ist, so kann man ihn auffassen als cine lineare Uberlagcrung des mittlcren Potentials der A' im Grundzustand bcfindlichen Atome mit der durch die AA^ angeregten bzw. ionisierten Atome verursachten Storung. Dann er- gibt sich, daB die Anderung des mittlcren inneren Potentials nicht zu A A^ Wsondcrn zu (A A^W)i pro- portional ist. Wenn also beispielsweise jedes tau- sendste Atom durch unelastischen StoB ionisiert ist, steigt das inncre Potential nicht um ein Promille, sondern um 10 "^'o. Fine solchc Zunahme kann aber schon zu erkennbarem Kontrast fuhren. Diese dritte Wurzel bewirkt aber auch, daB cine sehr starke Erhohung der Stromdichte im Objekt iiber den normalen Wert hinaus das inncre Potential und damit den Kontrast nur um einen geringen Betrag iiber den Wert erhohen kann, wie er bei der normalen Stromdichte bereits gegeben ist. Herrn Prof. Dr. B. v. Borries sowie Herrn Dr. F. Lenz danke ich fur wertvolle Anregungen und Diskussionen zur vorliegenden Untersuchung. LiTERATUR 1. Bethe, H., Ann. Physik, Lpz., 87, 55 (1928). 2. VON Borries, B.,Z. wiss. Mikroskop. 60, 329 (1952). 3. Lenz, F., Z. Naturforsch.9a, 185 (1954). 4. — eingereicht zur ,, First Regional Conference on Electron Microscopy in Asia and Oceania, Tokyo", Oktober 1956. 5. Lenz, F. und Scheffels, W., Z. Nattirforsch. 11a, 656 (1956). 6. Le Poole, J. B., Diskussionsbemerkung zum Vortrag von W. Scheffels, B. v. Borries und F. Lenz, Proceedings of the Conference on Electron Microscopy. London, 1954. 7. Scheffels, W., von Borries, B., und Lenz, F., Rapport Europees Congres Toegepaste Electronenmicroscopie Gent 1954, 293. 8. — Natuiwissenschaften 4\,%'i (\95A). 9. — Proceedings of the Conference on Electron Micros- copy. London, 1954. Contraste de phase et contraste interchromatique Etude comparee des methodes M. LoCQUIN Museum., Pans Le fonctionnement du dispositif comportant un cone creux d'electron tangent au bord d"un dia- phragme a bords amincis se revele different suivant : a) la plus ou moins grande tangence du cone sur les bords du diaphragme; b) Tepaisseur de Tobjet. Dans le cas des objets minces et lorsque le faisceau n'empiete pas sur les bords du diaphragme on a une image dont la structure ressemble exactcment a rimage en contraste de phase d'un microscope photonique, c"est a dire que les contrastes dans certaines limites sont approximativement propor- tionnels a Tepaisseur de Tobjet multipliee par son indice, c"est a dire dans le cas des electrons par les poids atomiques des structures traversees. Dans le cas des objets epais pour un reglage du cone d'eclairage traversant les bords amincis du diaphragme la structure de Timage est totalement differente. Avant de proceder a I'analyse detaillee de cette structure etant donne que les images possedaient un intervalle de contraste sur le negatif trop grand pour etre aisement copiable sur un positif a Taide de photons sans perte des details nous avons mis au point avec MM. Mollinat et Weber un procede de transposition en couleurs qui triple rintervalle des densites copiables et dont voici le principe : Du negatif unique on tire par voie photographique trois positifs correspondant a trois branches de den- sites croissantes du negatif. La premiere tranche est Einfliifi von Temperatiir, Unterlagc ami Bedeck ung auf Praparate 79 obtenue par copie sur une emulsion a grand contraste a Taide d'un temps de pose juste suffisant pour cn- registrer les faibles lumieres du negatif. Les grandes densites sent obtenues dc la meme fagon ma is en travaillant sur un positif intcrmcdiaire. La tranche moyenne est obtenue apres confection d'un masque des grandes lumieres du negatif que Ton superpose a celui-ci et tirage sur emulsion dure de I'image complexe ainsi obtenue. A partir de ces trois cliches on tire trois matrices en gelatine qui sont impregnees des trois couleurs fondamentales et dechargees successivement apres reperage sur papier. On obtient ainsi une transposition en couleurs des contrastes de I'image. Suivant I'ordred'impregna- tion des trois matrices on peut obtenir six images physiquement equivalentes mais donnant physiolo- giquement a I'oeil de I'observateur une impression fort differente. Seules deux images sont aisement interpretables, I'une dans le cas des fortes densites de I'objet, I'autre dans le cas des faibles densites. L'examen de ces images montre immediatement que les contrastes ne sont pas comme dans le cas du contraste de phase proportionnels aux epaisseurs optiques de I'objet. Les contrastes semblent parfaitement indepsndants de I'epaisseur de I'objet et lies uniquement aux poids atomiques des structures traversees. Pour en etre certains nous avons effectue des microincinerations par bombardement electronique dans le corps du microscope lui-meme des fibres observees et pris des images successives jusqu'au squelette mineral final. Ainsi on a pu mettre en evidence que les parties de fibre dans lesquelles se trouvaient concentres les atonies de calcium etaicnt ceiies qui presentaient le plus grand contraste et que ce contraste etait prati- quement independant dc I'epaisseur dc la fibre ou de ses details. Nous avons baptise ce phenomene nouveau du nom de contraste interchromatique rappelant ainsi que le contraste nait cntre des faisceaux d'electrons ayant subi d'abord au niveau de I'objet puis au niveau du diaphragme des pertes chromatiqucs ap- proximativement equivalentes; le diaphragme objec- tif etant suppose homogenc et I'objet hetcrogene les pertes chromatiqucs subies a la traversce de I'objet different statistiquement suivant les points de celui-ci des pertes chromatiqucs moyennes en quelque sorte compensatrices subies a la traversee du bord mince du diaphragme. La compensation parfaite ne pourra se faire que pour les quelques points de I'objet dont les poids atomiques seront en principe egaux aux poids atomi- ques des constituants du diaphragme. L'augmentation et la diflferenciation des contrastes aura done pour origine la plus au moins grande compensation des pertes chromatiqucs produites au passage a travers le diaphragme. II en resulte un contraste proportionnel aux poids atomiques des structures traversees et pratiquement independant de I'epaisseur de I'objet. Ceci n'est vrai en toute rigueur que pour une ouverture du systeme optique electronique non finie. Comme I'ouverture des objectifs est petite il faut superposer a ce phenomene I'efTet de la diaphragma- tion et les contrastes deviennent alors lies aux poids molcculaires plus qu'aux poids atomiques de Tobjet. Der EinfluB von Temperatur, Unteiiage und Bedeckung auf die Veninderung elektronenmikroskopischer Priiparate K.-J. Hanszen Physikalisch- Technische Buiidesaiistall, Biuuiischweig Jede optische Abbildung ist mit einem EingriflT der abbildenden Strahlung in das untersuchte Objekt verbunden. Je kleiner die abzubildende Einzelheit um so groBer die Wirkung des EingrifTs auf sic. Dieses grundlegende Gesetz laBt erkennen, wie sehr das Problem der Objektschiiden im Elektronenmi- kroskop mit wachsendcr VergroBerung an Tragweite gewinnt, da die unverfiilschte Wiedergabe von Struk- tureinzelheiten, die auf Grund des apparativerreich- baren Auflosungsvermogens noch moglich sein sollte, durch diese wesentlich behindert wcrden kann. Die primiire Folge der Wechselwirkung zwischen den einfallenden Elektronen und dem Objekt beste- hen in Anregung, lonisation und anderen quanten- haften Veranderungen der getrofFenen Molckiile, die sekundiire Folge in einer pauschalen Erwiirmung des ganzen Objckts. Durch vergleichende Hetrachtung der im Elcktronenstrahl und der tei Temperaturbc- handlung hervorgerufenen Veranderungen in organi- schen Priiparaten konnten Konig und Mitarb. (5, 6) die thermischen Schiiden von denjenigen trennen, die auf spezifisch elektronische Wcciiscluirkungen zu- riick/ufuhren sind. Ahcr auch die rein temperaturbedingten Schiiden konnen im Elektronenmikroskop wesentlich andcrs verlaufen als die thermischen Umvvandlungs\or- giinge in iciiwn Substan/en (3, 4), da die Praparate im Elcktronenstrahl einerseits mit der Triigerfolie, andererseits mit den sicli auf ihnen niederschlagen- den .,Kohle"-Bedeckungen reagieren konnen. Aus 80 K.-J. HANSZEN B.«t-<4.~ia ^'St%^v ' Fig. 1. Locherbildungen in einer SiO-Tragerfolie durch Reaktion mit Kupferoxyd (obenj und mit Eisen (unten) bei hohcn Bestrahlungsintensitaten. diesem Grunde kommt z. B. der Temperaturbestim- mung im Elektronenmikroskop durch Beobachtung von Schmelzprozessen und anderen thermischen Um- wandlungen nur ein beschrankter Anwendungsbe- reich zu. Ein Beispiel fiir eine Reaktion mit der UnterJage stellt die in Fig. I a wiedergegebene Zerstorung einer SiO-Tragerfolie durch ein Kupfer(I)Oxydpraparat dar, die bei hoheren Bestrahlungsintensitaten ein- tritt. Wiihrend der Reduktion des Oxyds im Elek- tronenstrahl reagiert dieses unter Locherbildung mit der Unterlage. Da iihnliche Erscheinungen auch nach Tempern im Vakuumofen, hier allerdings erst iiber 900'C, d. h. nach vollstandiger Reduktion des Oxyds zu Kupfer beobachtet wurden, liegt es nahe, auch im Elektronenmikroskop einen hauptsachlich durch dicTemperaturerhohungbedingten Reaktions- ablauf anzunehmen, der jedoch durch quanten- bedingte Ursachen friiher in Gang kommen kann, als auf Grund der pauschalen Temperaturerhohung des Praparats zu erwarten ist. Ein weiteres Beispiel fiir die Locherbildung in einer SiO-Unterlage durch Reaktion mit dem Praparat zeigt die Fig. 1 b. Hier haben verdampfende Eisenkiigelchen die Tragerfolie auf ihrem Weg angefressen. Von weitaus groBerer Bedeutung ist der EinfluB der erwahnten „K.o\\W-Bedeckiingen auf die Prii- paratveranderungen. Ihre Mitwirkung bei den tem- peraturbedingten Umwandlungen wurde durch Va- kuumtempern von Objekten ermittelt, die im Elek- tronenstrahl oder durch Bedampfen mit einer Kohle- deckschicht versehen waren. Durch Vergleich der nach den Erhitzungen im Ofen beobachteten Ver- anderungen mit den im Elektronenmikroskop durch die Elektronenbestrahlung hervorgerufenen Schaden konnten Ruckschlusse auf den EinfluB der Bedek- Fig. 2. Zerstorung einer 100 A dicken Silberaufdampfschicht auf SiO-Unteriage durch Tempern im Vakuumofen. Linke Spalte: unbedeckte Schichten; oben: nach Tempern auf 200 C; unten: auf 500'C. Rechte Seite: Schichten mit einer im Elektronenmikroskop entstandenen Kohlebedeckung: oben: nach Tempern auf 200 C; unten: auf 500 C. kungen bei den Veranderungen im Elektronenmikro- skop gezogen werden. Fig. 2 zeigt in der linken Spalte 5/7/)t^raufdampf- schichten, die vor der elektronenmikroskopischen Aufnahme einer kurzzeitigen Erhitzung unterworfen waren. Auf Grund von Adsorptionsschichten auf der Unterlage und der Schicht selbst besitzen die Atome an den Oberflachen der Silberpartikel eine so groBe Beweglichkeit, daB sich die Teilchen bei den Erhitzungen auf die angegebenen Temperaturen be- reits vollstandig abgerundet haben. Ganz anders verhalten sich Praparate, die schon vor dem Tempern dem Elektronenstrahl ausgesetzt waren, also mit .,Kohle" iiberdeckt waren (Fig. 2, rechte Spalte). In diesen Fallen vermag die Kohle die morphologische Schichtstruktur noch bei 200'C praktisch vollstandig zu schiitzen. Bei hoheren Tem- peraturen tritt dagegen eine vermehrte Aggregation der Silberschicht zu groben Klumpen ein. Es sieht so aus, als ob jetzt durch die Kohlebedeckung eine weitere Lockerung der Atome an den Oberflachen der Silberpartikel verursacht wird, die sich in einer gesteigerten Beweglichkeit dieser Atome auswirkt. Fijr die Moglichkeit einer solchen Herabsetzung der Bindungsfestigkeit der Oberflachenatome gegenuber dem Kristallgitter spricht auch die Tatsache, daB selbst in den durch die Bedeckung geschutzten Einflufi von Temperatur, Unterlage und Bedeckunf^ auf Piciparate 81 Fig. 3. Zerstorungen einer 100 A dicken Silberaufdampf- schicht durch Bestrahlungen im Elcktronenmikroskop. Unter den gewiihlten Fokussierungsbedingungcn sublimiert die Schicht ohne Aggregation. Schichten an einzelnen Stellen eine Luckenbildung durch Suhliiiuition der Silberpartikel eingetreten ist (s. Fig. 2). Die Vorstellung, daB es sich hier um eine bevorzugte Oberflachenverdampfung des Silbers un- ter der Einwirkung der Umhiillung handelt, wird durch die Tatsache bestatigt, daB Liickenbildungen dieser Art bei einer Zerstorung der Schicht durch Bestrahlung im Elcktronenmikroskop in erhohtem MaBe auftreten; denn in diesem Fall ist die Wirkung der Bedeckung besonders stark, da sie sich wiihrend der ,,Verdampfung'" auf der frisch gebildeten Silber- oberfliiche immer wieder neu niederschlagen kann. So erkliirt es sich, daB Silberschichten im Elektronen- strahl unter geeigneten Umstiinden ohne vorherige Aggregation vollstiindig abdampfen konnen (Fig. 3). Zur Klarung der Ursache fiir die vermehrte Su- blimation der Aufdampfschichten durch die Bedek- kungen soil Fig. 4 herangezogen werden. Sie zeigt ei- nen im Verdampfungsstand mit 200 A Kohle iiber- decktenSilberkeil nach Tempernauf 185 C. In diesem Bild fiillt auf, daB die groBten Zerstorungen nicht im diinnsten Schichtbereich auftreten, sondern bei einer Schichtdicke, die mit der Starke der Kohlebcdeckung korrespondiert. Hieraus glauben vvir, den Vcrdamp- fungsmechanismus nach folgender Vorstellung er- klaren zu konnen: Wahrend die aufgedampfte Kohle die Schicht- strukturen am diinnen Ende des Silberkeils liickenlos Fig. 4. Zerstorungen in einer keilformigcn Silberschicht, die durch BedampfLuig mit einer 200 A dicken Kohleschicht bedeckt wurde, dLircli Tempern auf 185 C. Die Liickenbiidung iriit vornehmlich bei einer Silberdicke von 200 A auf. zudcckt imd konserviert, liegt bei den groBeren Schichtdicken nur eine unvollstiindige, schneehiiub- chenartige Bedeckung vor (Fig. 5). Vor allem an den Rissen in der Silberschicht tritt eine Unterbrechung der Bedeckung auf. Die Kohle wandert aber an die- sen Stellen auf Grund ihrer groBen Oberlliichcnbe- wegHchkeit weit in das geometrische Schattcngebiet hinein und uberzieht dort das Silber mit einer extrem diinnen Absorptionsschicht, die zu der besprochenen Lockerung der Oberflachenatome des Silbers AnIaB geben kann, so daB die beobachtete Sublimation mogiich ist. Bei starkerer Erhitzung losen sich schlieBlich, von diesen Stellen ausgehend, die Hiillen vollstandig auf und geben zu den gefundenen Aggre- gationen AnIaB. Eine Bestiitigung fiir diese Erklarung bietet die Tatsache, daB unter wechselndem Winkel bedampfte Silberschichten nach dem Tempern we- Bedeckung ^Tragerfolie Fig. 5. Querschniu durch eine kohiebedeckte Silberschicht. Bestrahlung Warmcableitung Fiu. 6 a. Warmezuleitung Fig. 6 b. Fig. 6. Schema der Warmeerzeugung und -abieitung. a) im Elektronenstrahl, h) im Vakuumofen. 6 — 568204 Electron Microscopy ^2 K.-J. HANSZEN Fig. 7. Zerstorungen in einer Wismutaufdampfschicht auf SiO-Unterlage durch Vakuumtempern auf 200'C. Oben: Unbedeckte Schicht mit Verschmutzung; unten: Schicht, mit einer im Elektronenmikroskop entstandenen Kohlebe- deckung. niger Lucken aufweisen als nur senkrecht bedampfte Silberschichten. Liickenbildungen der besprochen Art sind von Bryant und Mitarbeiter (1) erstmalig an Wisinut beo- bachtet worden. Sie erklarten diese Erscheinung als eine Verdampfung der Schicht an Stellen herabge- setzter Warmeleitfahigkeit durch mangelnden Kon- takt mit der Unterlage. DaB jedoch diese Erklarung den wesentlichen Kern des Vorgangs nicht triflFt, lehrt die Tatsache, daB die gleichen Schaden auch beim Tempern im Of en auftreten, wo ganz andere Warmeerzeugungs- und -ableitungsbedingungen vor- liegen und nach solchen Uberlegungen der beobach- tete Effekt nicht auftreten diirfte (Fig. 6). Der Dampfdruck des Wismuts Hegt um mehrere Zehnerpotenzen hoher als der von Silber. Aus diesem Umstand erklart es sich. daB bei diesem Metall auch Liickenbildungen durch Tempern unbedeckterSchich- ten, bevorzugt an verunreinigten Stellen, auftraten. DaB auch hier die Verdampfung durch die Kohle- hiille wesentlich gefdrdert werden kann, ist aus Fig. 7 zu entnehmen. Wiihrend beim Tempern von Silber auf niedrigere Temperaturen noch der schiitzende EinfluB der Um- hiillurg vorherrscht, tritt an A^w/T/t^/'Schichten schon unter den gleichen Bedingungen der gegenteilige Effekt ein: Bedeckte Kupferaufdampfschichten auf SiO-Trager weisen bereits bei niedrigeren Tempera- turen Lucken auf, wahrend unbedeckte Schichten noch nicht veriindert sind. Ebenso findet bei hoheren Temperaturen unter der Bedeckung eine vorzeitige Aggregation statt^ (Fig. 8). Bei der Interpretation dieser Befunde ist zu beden- Fig. 8. Zerstorungen in einer Kupferaufdampfschicht auf SiO-Unterlage durch Tempern im Vakuumofen. Oben: Auf 350X; unten: Auf 400-C. Linke Spake; Unbedeckte Schich- ten, im unteren BiJd beginnt SammelkristaUisation; rechte Spake: Schichten, mit einer im Elektronenmikroskop ent- standenen Kohlebedeckung. ken, daB das Kupfer mit seiner starken Affinitat zum Sauerstoff einen Reaktionsmechanismus auf- weist. der beim Silber unbekannt ist. In den Elek- tronenbeugungsdiagrammen der Kupferaufdampf- schichten traten stets neben den Cu-Refiexen dieje- nigen von Cu.O auf. Daraus isl zuschlieBen,daBdie Aufdampfschichten von einer dunnen Oxydulschicht iiberzogen sind, die eine ahnliche Schutzwirkung auf das darunter liegende Kupfermetall ausiibt, wie es oben von den Kohlebedeckungen auf Silber darge- legt wurde. An Hand der Beugungsdiagramme kann man belegen, daB die Zerstorungen der Kupfer- schicht erst dann beginnen, wenn durch die eintre- tende Temperaturerhohung die Oxydulschicht zer- stort ist. Nun findet aber, wie Erdmann-Jesnitzer und Gunther (2) darlegten, das Verschwinden dieses Oxyds nicht erst bei LJberschreiten der Dissozia- tionskurve statt. Vielmehr liegt der Dampfdruck des Oxyduls so hoch, daB bereits bei niedrigeren Tem- peraturen seine Sublimation eintritt. Nach dieser Verdampfung der Deckschicht hat aber der restliche 1 Auf Kohleunterlage ist die Beweglichkeit des Kupfers so groB, daB die Aggregation bereits auftrat, bevor eine Luckenbildung zu beobachten war. Ei?ifiiiP von Tempcratiir, Untcrloffc iiiul Bedeck iini; aitf Piciparate 83 Sauerstoff in der Vakuumapparatur Zutritt zu der reinen Kupferoberflache und kann mit dicser wiedcr zu CUjO reagieren, da wir uns noch oberhalb der Dissoziationsdruckkurve befindcn. Hiermit kann das Spiel von neuen beginncn, bis das ganze Kupi'er vcr- dampft ist. Die Oxydulschicht hat also beziiglich der Verdampfung eine Art katalytische Wirkung. Es darf nicht auBer Acht gelassen werden, daB bei den hier behandelten Mikrostrukturen wescntliche Verschiebungen der Gleichgewichtskurven auftreten konnen, bedingt durch die bekannten Effekte .,klei- ner Tropfchen" usw. Temperimgsversuche an zu CuO durchoxydierten Kupfcraufdampt'schichten, die untcr gleichen Bedingungen vvie die Kupl'ererhit- zungen angestellt wurden, bestiitigten dieses: Die Reduktion zu Oxydul tritt schon bei etwa 270°C, die zu Kupfer kurz unterhalb 400 C ein\ letztere also in dem Temperaturbereich. in dem sich die ersten Zerstorungen an unbedeckten Kupferschichten bc- merkbar machten. Im Gegensatz zu den Verhaltnissen an unbedeckten Schichten hat man es bei Vorhan- densein von Kohlebedeckungen nicht mit echten Gleichgewichtszustiinden, sondern mit reaktions- fiihigen Partnern im gehemmten Gleichgewicht zu tun. Hier kann also bereits vor der besprochenen Sublimation des Oxyduls seine Aufzehrung durch die Kohleeintreten. AusschlieBend vermag die Bedeckung auf Kupfer iihnliche Wirkungen wie auf Silber aus- zuiiben. Dieses steht im Einklang mit unserer Er- fahrung, daB die Liickenbildung und Aggregation bedeckter Schichten bei niedrigeren Temperaturen eintritt als von unbedeckten Schichten. 1 Es est zu beachten, daB die Oxyde mit der SiO-Unterlage in Beriihrung stehen. Veranderungen der Tragerfolie, wie sic anfangs beschrieben wurden. treten bei den hier benutzlen Temperaturen allerdings noch nicht auf. Eine Angabc des Zersetzungsmechanismus nach stochiometrisch festgelegten Umsetzungen, wie sie im vorlicgenden Beispiel versucht wurde, schcint nur in weiiigen Fallen moglich. Wie verwickelt aber auch die Umstiinde im Einzelfall liegcn, der wcsent- liche Vorgang all dieser Erscheinungen scheint in der Lockerung der Oberfliichenatome durch diinnste Adsorptionsschichtcn zu liegcn. Die mitgcteiltcn Ergebnisse beziehcn sich in der Hauptsache auf Praparatveriinderungcn durch Tcm- pern, unter Beriicksichtigung der moglichen Reak- tionen mit Unterlage und Bedeckungen. Es wurde also Thermod>'namik — odcr besscr gcsagt Thermo- statik — elektronenmikroskopischer Priiparate be- trieben. Neben den allgemeinen Bedenkcn, die man bei der Anwendung der Gleichgewichtslehrc auf reale Verhiiltnisse hegen muB, ist besonders zu beachten, daB die Objekte im Gegensatz zu den Ver- suchen im Vakuumofen unter dem Elcktronenstrahl nur noch sehr bedingt thermodynamische Systeme darstellen. Vor allem sind die unter diesen Umstan- den auftretendcn spezifisch clcktronischen EfTckte auf dem oben beschrittcnen Wege nicht erfaBbar. Um ihren EintluB zu beschrcibcn, bedarf es noch zahlreicher Versuchc auf anderer Grundlage. LiTERATUR 1. Bryant, P. J., Rhoads, U. H., und Weber. A. H., J. Appl. Pins. 25, 13,43 (1954). 2. Erdmann-Jesnitzer, F. und Gunther, F.,Z. Me/rt//A«/;(/e 45, 407 (1954). 3. Hanszen, K.-J., Physik. Verhandl. 6, 36 u. 58 (1955). (Kurze Sitzungsbcr.) 4. — Z. Naturforsch. lla, 878 (1956). Z. IDJ 98, 1709 (1956). 5. KoNiG, H.,Z. P/tysik 129,483 (1951). 6. KoNiG, H., Knoch, M., und Brockes, A.,Z. wiss. Mikro- skop. 62, 450 (1955). IV HIGH RESOLUTION ELECTRON MICROSCOPY AND ELECTRON DIFFRACTION Der Durchgang von Elektronenstrahlen durch das Kristallgitter iind seine Folsen filr das elektronenmikroskopische Bild H. NiEHRS Fiitz-Haber-Institut der Max-Planck-Gesellschaft, Berlin-DahJem VoR kurzem sind von Menter (2) die ersten elek- tronenmikroskopischen Abbildungen von Kristall- gitterstrukturen gezeigt worden. Sie mogen insofern noch als recht roh erscheinen, als nicht die Anord- nung der einzelnen Molekiile oder Atome sichtbar wird, sondern nur das streifenformige Bild einer bestimmten Netzebenenschar auftritt. Jedoch scheint der Zeitpunkt nicht fern zu sein, da die Elektronen- mikroskopie systematiscli als Mittel zur Aufklarung von Kristallgitterstrukturen und ihren Storungen eingesetzt wird. Bei diesem Stande der elektronenoptischen Auflo- sung, der in einigen weiteren Vortragen am heutigen Nachmittag zur Sprache kommen wird, ist es wohl auch von Interesse, sich dariiber klar zu werden, welches Bild ein ideales, ungestortes Kristallgitter im Elektronenlicht iiberhaupt zeigen kann; welche Elektronenstwmverteilimg in der beobachteten Stra/il- aiistrittsfldche des Kristalls auftritt, und wie sie von der Bestrahlung und der Objektdicke abhangt. Bei den in Frage kommenden Schichtdicken von bis zu einigen Hundert A ist es wesentlich die elastische Streuung im inhomogenen Potentialfeld des Kristall- gitters, die die Inhomogenitat der Strahldichte in der Austrittsflache hervorruft und das Aussehen des Kristallgitters bestimmt. Daher ist grundsatzlich die dynamische Theorie der Elektroneninterferenzen beru- fen und imstande, iiber die oben gestellten Fragen Auskunft zu geben; denn gerade sie beschreibt das Verhalten von Elektronenstrahlen beim Durchgang durch das periodische Potentialfeld des Kristall- gitters. Auf diese Bedeutung der dynamischen Beu- gungstheorie fijr die Deutung von elektronenmikro- skopischen Kristallstrukturbildern mochte ich hin- weisen und die Aussagen der Theorie in groben Um- rissen darlegen. Von dieser dynamischen Theorie unterscheidet sich die bekanntere geometrische Theorie im wesentlichen durch die Voraussetzung, daB die abgebeugten Strah- len — verglichen mit dem Primarstrahl — sehr schwach sind, so daB einerseits alle Elementarbe- reiche des Kristalls von der gleichen Primarintensitat getroflFen werden, und daB andererseits abgebeugte Strahlen keine nennenswerte weitere Abbeugung er- leiden. Erfiillt ist diese Voraussetzung in sehr diinnen Kristallen oder bei mangelhaft erfijllter Interferenz- bedingung. Infolge ihrer Annahme braucht die geo- metrische Theorie fiir ihrZiel, die Beschreibung des Beugungsbildes, nicht die Vorgdnge im Kristallgitter selbst in Betracht zu ziehen. Die dynamische Theorie geht grundsatzlich anders vor. Sie untersucht zunachst, in welcher Form die Elektronen das Kristallgitter iiberhaupt durchlaufen konnen, d. h. die moglichen sog. Wellenfelder. In einer zweiten Stufe liefert das Studium der Grenz- und Abstrahlungsbedingungen an der Strahlein- trittsflache sodann die Starken der hier abgestrahlten Wellenfelder. In einer dritten Stufe werden schlieB- lich die von der Strahlaustrittsflache abgestrahlten Interferenzstrahlen bestimmt. Die dynamische The- orie betrachtet also wesentlich das dynamische Gleich- gewicht der im Kristall auftretenden Wellenfelder, wenn eine primare Erregung vorliegt. Diese Behand- lung hat den Vorzug, daB sie 1. auch starke Inter- ferenzwirkungen beschreiben kann, und daB sie 2. auch Aussagen iiber das Geschehen //// Kristall- gitter macht. In Ubereinstimmung mit den Beu- gungsbeobachtungen ergibt sich, daB schon fiir Kri- stalldicken von etwa 100 A bei bestimmten Kristall- orientierungen die dynamischen Wechselwirkungen erheblich sein konnen, sodaB die geometrische Theo- rie dann recht unzuliinglich wird, wahrend die dyna- mische Theorie alle experimentellen Ergebnisse der Elektronenbeugung zu erklaren erlaubt. Diese Tat- sache scheint mir zu rechtfertigen, daB sich auch die Elektronenmikroskopie ihrer vertrauensvoU bedient, wenn es sich um Abbildungen des Kristallgitters handelt. Die Grundaussage der dynamischen Theorie ist, daB die Elektronen das Kristallgitter im allgemeinen nicht in Form von ebenen Wellen, sondern nur in Form von Wellengruppen besonderer Struktur T(K, r) = const. v,,^^ . ^-2^'(A'+f>ft.r)^ ft den schon erwahnten Wellenfeldern durchlaufen. Sie konnen gedanklich als Superpositionen ebener Wel- len mit den Wellenvektoren K + b,, aufgefasst werden, worin b;j den reziproken Gittervektor zum Index- tripel // ( ={hjijh,)) bedeutet, d. h. einen Vektorsenk- recht zur Netzebenenschar //, dessen Betrag gleich dem Reziproken des Netzebenenabstands ist. K ist ein fur das betreflFende Wellenfeld charakteristischer Grundvektor, durch den auch die Partialamplituden //„, also die Struktur des Wellenfeldes, eindeutig festgelegt ist, allerdings bis auf den voranstehenden konstanten Faktor, der die Starke des Wellenfeldes beschreibt. (r ist der Ortsvektor im Kristall.) TriflFt ein Primarstrahl einheitlicher Richtung und Energie auf die Grenzflache des Kristalls, so setzt er sich in diesem in einer Linearkombination 3 Dcr Diirchgan},' von Elektronenstnihlen diiich ilas Kiistalli^iller 87 solcher Wellent'elder fort, wobei die verschicdencn Grundvektoreii K; der einzelncn Wcllenfelder sich selbst zwar sehr wenig voneinander und von dcm primiiren Wellenvektor unterscheiden, die Amplitu- dcnstruktur der Wellcnfelder abcr sehr untcrschicd- lich sein kaiin. Die Anzahl dcr in dieser Linearkombi- nation enthaltenen Wcllenfelder ist eng verkniipft mit der Anzahl (A^ 1) dcr Partialwelien je eines Wellenfcldcs. wobei TV zuglcich die Miihiplizitiit dcr Inwrfercnz ausdriickt. Tatsiichlich wiirde im intcr- ferenzfreien Fall A^ nur 1 Wellenfeld bcstehend aiis nur 1 Partialwelle // (000) aiiftreten. Dieser interferenzfreie Fall kommt aber praktisch nie vor, und es sei sogleich bemerkt, dafJ cs besonders bei der Bestimmung der Stromverteilung in der Strahl- austrittstliiche des Kristalls meistens wesentlich auch auf die zahlreichen schwachen Interferenzen an- kommt. Bei einer N-fachen Interferenz treten, von Sonderfiillen abgesehen, als Fortsetzung des Pri- miirstrahls bei Durchstrahlung A^ -i- 1 Wcllenfelder auf, von denen jedes eine unabgebeugte Partialwelle zum Indextripel /; == (000), sowie A^ abgebeugte Par- tialwelien zu Indextripcln /; ^r- (000) umfasst. Die gruppenweise Zusammenfassung der insge- samt (A' ; 1)- Partialwelien im Kristall zu A' + 1 Wellcnfeldern mag zunachst recht willkiirlich und sinnlos erscheinen; sie hat aber einen sehr realcn physikalischen Grund. Die partiellen Losungen der Schrodingcrgleichung im Kristallraum sind eben nicht die einzelncn cbcncn Partialwelien, sondern nur die komplctten Wcllenfelder. Nicht die einzelncn ebenen Partialwelien, wohl aber die einzelncn Wcl- lenfelder konnen im Kristall unabhiingig voneinan- der fortschreiten. Das Wellenfeld ist mithin Triigcr dcr Elektronenstromung, und bei geniigcnd engcm Strahlquerschnitt stellt cs einen Elektroncnstrahl mit eigener Strombahn bestimmtcr Richtung dar. Die Fortschreitungsrichtung eines Elektronenstrahls im Kristall ist daher nicht unmittelbar durch die Wel- lenvektoren K i b^ gcgeben, sondern durch den Stromdichtevektor des komplctten Wellenfeldes. Es ist daher besser, den Elektroncnstrahl im Kristall nicht als Superposition von ebenen WcUen, sondern als eine Elektronenstromung, die mit der Periodizitcit des Gitters modidiert ist, aufzufassen. Die Multiplizitat der Wcllenfelder andcrerseits be- dcutet, daB der Primiirstrahl sich beim Eintritt in den Kristall unter Mehrfachbrechnng, bei A'-fach- Interferenz unter (A'^ + l)-fach-Brechung, fortsetzt. Ebenso erleidet das einzelne Wellenfeld im Kristall beim Auftreffen auf cine Grenznache cine Mchr- fachreflexion in neue Wcllenfelder, die jedoch prak- tisch stets zu vcrnachlassigcn sind. Beim Austritt aus dem Kristall freilich zcrfiillt das Wellenfeld (unter gleichzeitigcr Brechung) in seine Partialwelien, da diese im Vakuum unabluingig voneinander als Inter- fercnzstrahlen weiterlaufen konnen. Erst hier bc- stimmt der (durch Brechung modifizierte) Wellen- vektor K + b;j wieder die Strahlrichtung. Unter den ublichcn cxperimentellcn Bedingungen haben die \on den verschiedenen Wcllenfcldern / umfaBten Partialwelien gleichen Indextripels // nur sehr wenig verschicdene Wellenvektoren K^ f b/j. Zu- sammen liefcrn sie nach Austritt einen aiifgespaltenen Interferen/strahl li, wobei die Starke der Aufspaltung sehr wesentlich auch von der Lage der Austritls- niiche abhiingt. Beim planparallelen Kristall setzen sie sich geradc zu einem iinaiifgespaltenen Interfe- rcnzstrahl zusammen. Die Superposition der Partialwelien zu verschie- denen indextripeln h erzcugl in der Strahlaustritts- lliiche eine charakteristische Elektronenstromvertei- lung, die die periodische Struktur des Kristallgitters widcrspiegelt. Hinsichtlich der Intensitiiten jedoch besteht kcinc einfache Korrelation mit der Potcn- tialvcrtcilung im Kristallgitter. Lcdiglich wenn die Primarstrahlrichtung in eine Synimeirieaclise des Kristalls fiillt, darf man erwarten, daB vor den Ato- men der Austrittsllache sich auch Symmetriezentren (Maxima oder Minima) der Jntensitdt ausbilden. Die Multiplizitat der Wcllenfelder iiuBcrt sich beim plan- parallelen Kristall ferner in einer Abhiingigkeit der Stromverteilung von dcr Kristalldicke. Diese Ab- hiingigkeit ist bei A'-fachcr interferenz darstellbar durch Superposition von A' periodischen F-unktionen der Kristalldicke. Uber die Ergebnissc einer solchcn Berechnung dcr Stromverteilung in der Strahlaus- trittsfliichc des MgO-Kristalls wird andcrnorts he- richtet (3). Bei Durchstrahlung keilfiirmiger Kristallbereiche von Polyedern erscheint diese Dickenabhiingigkeit bereits innerhalh eines clektronenmikroskopischen Bildes, da der Strahlwcg im Kristall dann von Objcktpunkt zu Objektpunkt variiert. Im Falle dcr einfachen Interferenz z. B., bei der im Kristall 2 Wcllenfelder laufen, tritt im Bild die bekannte ein- fach-periodische Streifung parallel zu den brechen- den Kantcn auf. wie sie crstmals von Heidenreich und Kinder (1942 43) beobachtet und \on Kosscl (1943) als ,,Linien glcicher Kristalldicke" gcdeu- tct worden ist. Bei der Aullosung von Kristallgit- terstrukturen im elektroncnmikroskopsichen Bild wi.irdc sich diese Streifung mit ihren Periodenbreiten von etwa 100 A dcr gitterperiodischen Stromvertei- lung uberlagern, wodurch sich unter I'mstiinden ein zicmlich kompliziertes Bild ergibt. Zum AbschluB sei noch ein Hinweis auf die Absorption der Elektroncnstrahlen, genauer die Schwiichung der kohiircnten Biindels, im Kristall gestattet. Eine der Opiik analoge Erweiterung der dynamischen Theoric unter Beriicksichtigung der Absorption liiBt vermuten, daB die verschiedenen. als Folge der Interferenzen auftretenden Wcllenfelder sich nicht nur hinsichtlich der Brechung, sondern auch hinsichtlich der Absorption verschiedcn ver- halten. Dies liiBt sich im einfachsten Falle am Beispiel optimaler Einfachinterferenz anschaulich in folgender Weise verstehen: Die beiden in diesem Falle auftretenden Wcllenfelder enthaltcn je 2 Par- tialwelien und stellen Elektroncnstrahlen dar, die 88 J. W. MENTER quer zu der die Interferenz hervorrufenden Netz- ehenemchar modidiert sind und parallel zu dieser Netzebenenschar fortschreiten. Die Modulation des einen Wellenfeldes ist derart, daB die Stromdichte- maxima, die Schwebungsbauche, gcnaii in den Netz- ebenen, die Stromdichte/;/m//Hrt, Schwebungskno- ten, in der Mitte zwischen den Netzebenen liegen. Genau umgekehrt ist die Modulation des anderen Wellenfelds: Maxima zwischen, M/>7/ma m den Netz- ebenen. Das erste Wellenfeld fuhrt seinen Elektro- nenstrom also hauptsachlich in den Aromehenen, das zweite Wellenfeld hauptsachlich rii7,vf7/('// den Atom- ebenen durch das Kristallgitter. Es ist verstandlich, daB der Elektronenstrom des ersten Wellenfeldes von der Absorption durch die Atome starker be- trofTen wird als der des zweiten Wellenfeldes. Theorie und Beugungsbeobachtungen ( 1 ) zeigen iibereinstim- mend — quantitative Messungen liegen freilich nicht vor — , daB von den beiden bei Einfachinterfe- renz beobachteten Wellenfeldern das eine iibernor- mal stark, das andere iibernormal schwach im Kri- stallgitter absorbiert wird. In der elektronenmikro- skopischen Beobachtung sollte sich dieser Eflfekt in einer iibernormalen Dwchldssigkeit von Kristallen groBerer Dicke bei Interferenzstelhingen kundtun. Vielleicht bietet sich dadurch die Moglichkeit bei hinreichender elektronenmikroskopischer Autlosung, den Strahlweg im Kristall zu demonstrieren oder auch Kristallgitter groBerer Dicke abzubilden. Ich mochte nicht versaumen zu erwahnen, daB die Entwicklung, der hier skizzierten Theorie weitge- hend gefordert worden ist durch analoge Beobach- tungen und (Jberlegungen von v. Laue und von Borrmann auf dem Gebiet der Rontgeninterferenzen. LiTERATUR 1. Altenhein und Moliere, Z. Pliysik (1954). 2. Menter, J. W., Proc. Roy. Soc. A 236, 119 (1956). 3. NiEHRS, H., Optik (1956). The Resolution of Crystal Lattices J. W. Menter Tube Investments Research Laboratories, Hinxton Hall, Essex. The possibility of resolving atoms in the electron microscope has been discussed by a number of wor- kers including Hillier (4), Schiff (8), Boersch (2), Scherzer (7) and Haine (3). The basic assumption of their treatments has been to consider two isolated atoms each forming its own Airy disc pattern in the image. It is assumed that there is no coherence be- tween the electrons scattered from these two point objects and the criterion for resolution is that the intensity dip between the Airy disc patterns shall just be perceptible. If the atoms or molecules are arranged in a regular array, as in a crystal lattice, for example, resulting in definite phase relationships between electrons scattered from neighbouring atoms then the mechanism of image formation is rather different. Strong diffracted beams are formed and it has been pointed out by some of these workers that under these conditions the instrumental resolution required to resolve regular arrays of atoms or mole- cules is not so high as in the case of isolated noncohe- rent objects. The resolving power of the Siemens Elmi- skop I as limited by the diffraction error and spherical aberration alone is 2.8 A. This is worsened in practice by the chromatic error and astigmatism to 7 A. We were thus encouraged to attempt the direct observa- tion of crystal lattices in crystals with relatively large lattice parameters. After the macromolecular crystals of viruses and proteins, the structures of which have been beautifully demonstrated by WyckofT (9) using replica methods, the most likely class of compounds with smaller lattice parameters are organic molecules Fig. 1. Schematic projection of platinum phthalocyanine Fig. 2. Unit cell of platinum phthalocyanine crystal. Circles molecule normal to the phthalocyanine ring (after Robertson represent molecules, the metal atoms being situated at the and Woodward 1940). • C; O CH; O, N centre of the circle. The Resolution of Crystal Lattices 89 Fig. 3. Crystal habit ofcoppcr plitlialocsanine (after Robert- son, 1934). with intermediate molecular weights. Among these the phthalocyanines appeared a promising group to study and most of our work so far has been carried out on copper and platinum phthalocyanine. The metal phthalocyanines have a number of favourable properties. The molecule of platinum phthalocyanine is shown in figure I, and the unit cell of the crystal lattice in figure 2. From these it is apparent that we may idealise the structure into widely spaced planes of heavy metal atoms (^^o,,, 1 1.94 A) embedded in a matrix of the light elements carbon, nitrogen and hydrogen. We would expect to obtain strong diffracted beams from these planes even in very thin crystals since the scattering from the heavy metal atoms swamps that from the organic parts of the unit cell. The crystals grow as long thin ribbons with (001) as the habit plane of the ribbon surface as shown in figure 3, so that crystals sup- ported on a specimen grid will be oriented with (001) perpendicular to the electron beam and (20T) almost Fig. 4. Schematic representation ol"(20T) planes in platinum phthalocyanine in relation to crystal habit. ABCD is a (001) plane. The almost vertical sheets such as ABEF arc (20T) planes. parallel to the beam, since (001)A(20T) =88". The (201) planes are thus in a favourable orientation for diffraction, which is essential in order to form an image of the planes. A schematic representation of the nearly vertical (20T) planes is shown in figure 4. In copper phthalocyanine the corresponding para- meters are (001)A(20T) 80 , f/201 = 9.8 A. Preparation of specimens and method of examina- tion. — The crystals were prepared by sublimation from the powder after the method of Barrett, Dent & Linstead (I). After irechanical breaking down to reduce their size they v\ere suspended in ethyl alcohol, and a drop of the suspension dried down on to a Fig. 6. Single edge dislo- cation in platinum phtha- locyanine crystal ( 1,000.000). Fig. 7. Guide to figure 6 showing exact position of edge dislocation. Fig. 5. Portion of platinum phthalocyanine crystal showing perfect structure of (20T) planes ( < 1,500,000). 90 J. W, MENTER HlWWi^ m Fig. 8. Copper phthalocyanine crystal showing dislocated region associated with change in width of crystal. nitrocellulose supporting film, containing a large number of holes. It was found that the image was seen to the best advantage when not overlaid with the structure of the supporting film. The specimens were examined in the Elmiskop I operated at 80 kV, using the fine focus condenser (aperture 200 //) and a 50 /( objective aperture (unless otherwise stated) and recorded on Ilford Contrasty Lantern plates at a magnification of 77,000 times. Results. Platinum phthalocyanine. — A considerable number of plates revealed the structure shown in fig- ure 5, consisting of a series of parallel linesinthe[010] direction, the spacing of which was 12.0 A, averaged from measurements on 26 crystals with a standard deviation of 0.2 A (see Table 1 ). These lines may be regarded as the image of the projection of (201) planes seen edge on. Bent crystals have been observed in which the bending of the crystal planes follows the external form of the crystal as would be expected. Imperfections are sometimes seen in the structure in the form of edge dislocations. A particularly simple example is shown in figure 6, the exact position of the incomplete plane being clarified by the sketch in figure 7 which has been copied from the micrograph. Copper phthalocyanine. — Similar results have been obtained with copper phthalocyanine, although less frequently, since the probability of finding a crystal in a suitable orientation for diftYaction is lower on account of the smaller value of (001)A(20T). Two values have been obtained for the spacing of the planes. The first 10.30 ±0.3 A averaged from eight measurements differs significantly from the x-ray value of 9.8 A, and a few isolated values of about 13 A have been observed. There are a number of possible reasons for this discrepancy which are dis- cussed more fully elsewhere (5). A particularly good example of a dislocated lattice is shown in figure 8 where a severe disturbance of the lattice is associ- ated with a change in width of the crystal at the point X. Cracks have been observed in crystals in which the crack may be seen to propagate from one plane to its neighbour as it traverses the lattice. Sodium faujasite. — This is the first inorganic mate- rial in which the crystal planes have been resolved. It is a network silicate structure with the composition 2Al,O3-CaO.Na2O.10 SiO,.20 H.p, being cubic with ao = 24.84 A. The (111) spacing is 14.37 A and the mean of measurements from 16 micrographs gives ^,111; =" 14.4 ± 0.2 A (see Table 2). Figure 9 shows a crystal of this compound revealing the (111) planes. Fig. 10 shows a crystal viewed along the [110] axis in which two sets of ( 1 1 1) planes intersecting at 70^ are resolved. Mechanism of image formation. — The crystals being thin, form a cross-grating diffraction spectrum since the third Laue condition for diffraction from Table 1. Spacing of lines in platinum phthalocyanine. (All plate magnifications 77,000 ) Plate no. No. of spaces measured Average distance be- tween lines on plate (mm) Distance between lines in crystal (A) 1508 220 0.0935 12.1 1481 80 0.0914 11.9 1498 50 0.0916 11.9 1517 20 0.0955 12.4 1532 100 0.0926 12.0 1582 80 0.0920 11.9 1518 30 0.0950 12.3 1525 40 0.0950 12.3 1573 30 0.0933 12.1 1670 50 0.0934 12.1 1630 100 0.0917 11.9 1626 40 0.0907 11.8 1625 40 0.0900 11.7 1624 50 0.0910 11.8 1652 116 0.0919 11.9 1400 200 0.0919 11.9 1445 30 0.0917 11.9 1446 20 0.0925 12.0 1449 20 0.0895 11.6 1442 100 0.0935 12.1 1171 20 0.0935 12.1 1196 20 0.0890 11.6 1213 50 0.0932 12.1 1173 100 0.0900 11.7 1204 30 0.0940 12.2 1192 30 0.0927 12.0 The Resolution of Crystal Lattices 91 Fig. 9. Sodium faujasite crystal showing (111) planes. lattice rows in the direction of the beam is highly relaxed. With a 50 /< objective aperture, the spectra contributing to the image from the phthalocyanine crystals are the (20T), (402), 201) and (402). These spectra are assumed to recombine with the zero order beam in the image plane and form an image of the crystal grating in accordance with the simple Abbe theory of image formation by a lens. This has been confirmed by excluding all spectra except the zero order from the image by using a 10 // objective aperture when it is found that the image of the planes disappears. Further confirmation of this mechanism is obtained from the fact that an array of parallel lines rather than a cross grating of dots is seen in the image. The projection of the lattice in the direction of observation should show a series of planes (010) perpendicular to the (20T) planes. The spacing of ^^^l^r- iHM m these planes however is 3.81 A and the first permis- sible spectrum from them, (020), corresponds to a Bragg spacing of 1.905 A. This is excluded from the image by a 50 // aperture so that the image of these planes is not seen. It is doubtful on other grounds whether such a small spacing could be resolved. Firstly, the permis- sible misorientation of the crystal with respect to the electron beam, arising from the relaxation of the third Laue condition becomes smaller as the spacing to be resolved is reduced. Secondly the effect of spherical aberration in distorting the wavefront of a beam diffracted at a wide angle through the lens becomes so severe as to cause the diffracted beam to be no longer able to interfere coherently vsith the zero order beam and form the image. The effect of spherical aberration may already be severe even J. W. MENTER Fig. 10. Sodium faujasitc crystal viewed along [110] showing two sets of ( 1 1 I) planes intersecting at 70 '. with the (402) reflection corresponding to ^ = 5.97 A since a microphotometer trace across the image shows that the intensity distribution follows fairly closely a function of the form cos- 0. This would be expected from interference between two beams, i.e. the zero order and the first order (20T) indicating that although the (402) beam passes through a 50 /( aperture to the image it is making no useful contri- bution to the image of the planes. Resolution of image. — The high resolution appar- ent in the image can be explained in terms of simple lens theory: neglecting effects of chromatic aberra- tion and astigmatism, the phase delay imposed on a ray passing through a lens at an angle -x is given by e = J Cja*, where Cj is the spherical aberration con- stant. The diffracted beams from the crystal lattice may be regarded as plane parallel beams approxi- mately equal in width to the width of the specimen (neglecting the finite divergence of the incident illu- mination). Thus provided a and Cg are small the distortion of the wave front of the narrow diffracted beam in passing through the lens may be very small (7). A simple calculation shows that the difference in phase between the two ends of a wavefront of width Ir is given by Gr-* Ar /\ where /is the focal length of the lens and /■ the distance of the beam from the axis in the lens plane. Inserting values for the (20T) reflection from platinum phthalocyanine, /• 10-3 cm, Cs 0.28 cm,/ 0.3 cm, Ar 10^ cm, we find that the phase difference across the wavefront Ae = 3 > 10 '^ cm, i.e. ^e< /, since A =4 lO"'" cm. Thus the wavefront remains virtually undistorted in passing through the lens and is able to form an image of the (20T) planes by interference with the Ahhihhinii von Kristallf^'iitcrsinik lurcii 93 Table 2. Spacint; of lines in sodiiini faiijcisite. (All plate niagnitications 77,000 ) Distance between lines in eivstal (A) 14.6 14.7 14.15 13.9 14.3 14.55 14.8 14.65 14.4 14.6 14.4 13.8 14.0 14.45 14.55 14.7 zero order beam. Calculations suggest that it should be possible to resolve planes with spacings consider- ably smaller than 10 A providing that the divergence of the illuminating beam is made sufficiently small. Average No. of distance be- Plate no. spaces tween lines measured on plate (mm) 2020 100 0.1125 20 0.1135 2025 24 0.109 20 0.107 40 0.110 1959 80 0.112 70 0.114 30 0.113 1827 30 0.111 1826 20 0.1125 1834 30 0.111 1962 20 0.106 20 0.108 2030 30 0.111 2032 30 0.112 2036 20 0.1135 Should this prove to be true in practice there are many possibilities opened up in the study of crystal structures and their imperfections. The images ob- tained are, of course, very poor Fourier projections and show none of the detail obtained by x-ray analy- sis but they have the essential advantage of revealing the exact location of imperfections, thus permitting the direct study of the behaviour of dislocations under a variety of physical conditions. The idea of these experiments germinated in the course of a discussion with Mr. .1. h. Gordon. I wish to thank Mr. G. A. Bassetl for his careful attention to the per- formance of the microscope, Mr. R. W. Gooding for preparing the platinum phthaiocyanine. Professor R. M. Barrer and Mr. J. A. Gard for pro\iding samples of sodium faujasite. This paper is published by permission of the Chairman of Tube Investments Ltd. References 1. BARRF.rr, P. A., Dent, C. E., and Linstead, R. P., J. Chem. Soc. 1719 (1936). 2. BoERSCH, H.,Z. Naiiirforsch. 2a, 615 (1947). 3. Haine, M. E., AilviUic. Ek'ilronics Eleclrun Phvsics 6, 295 (1954). 4. HiLLiER, J., Pins. Rev. 60, 743 (1941 ). 5. Menter, J. W., Proc. Roy. Soc. A 236, I 19 (1956). 6. R0BERT.SON, J. M., J. Clwm. Soc. 615 (1934). 7. SCHERZER, O., J. Appl. Phys. 20, 20 (1949). 8. SCHIFF, L. I., Pliy.s. Rev. 61, 721 (1942). 9. Wyckoff, R. W. Ci., Lcs techniques rcccntes en micros- copic electroniquc cl corpusciilairc. Coll. Int. du CNRS, 135 (1956). Elektronenmikroskopische Abbildung von Kristallgitterstriiktiiren R. Neider Fiitz-Haber-Institut cler Max-Planck-Gesellschaft, Berlin-Dahlcni Die von der dynamischen Theorie derElektronenin- terferenzen ausgehenden Uberlegungen von Niehrs, welche dieser im vergangenen Jahr in unserem Insti- tut begonnen hatte, fijhrten zu Beginn dieses Jahres zu dem Ergebnis, daB die periodische Struktur des Kristallgitters eine ebensolche Struktur der Strahl- dichte in der Austrittsfliiche hervorruft, und — dies ist das bemerkenswerteste Ergebnis der Niehrsschen Arbeit — daB Atome oder Netzebenen mil vollig ausreichendem Kontrast abgebildet werden konnen. Voraussetzung ist natiirlich, daB die abzubildenden Netzebenenscharen von dem benutzten Hlektronen- mikroskop aufgelost werden, d. h. daB die /ugeho- rigen Interferenzstrahlen bei der Bildentstehung mit- wirken und die Storung diucii Linsenfehler genii- gend klein ist. Da uns das Elmiskop I der Siemens & Halske AG zur Verfijgung stand, suchten wir nach Kristal- len, die Netzebenenabstiinde der GroBenordnung 10 A und fijr die Abbildung geeignete Kristalltracht haben und schlieBlich als Untersuchungsobjekt ge- niigend bcstiindig sind. Hicrbei sticBen wir — ebenso wic Menter — auf die Gruppe der Metallderivate des Phthalocyanins. Wir erhielten Nickel-i'hlhaloc\anin von Drechsler und WoltT. welche in unserem Institut dicse Substanz auch bei ihrcn Untersuchungen im Feldcmissionsmikroskop \er\\endet hatten. Kupfer- Phthaloc\anin erhielten uir von der Badischen .'\ni- lin- und Soda-Fabrik. Wiihrcnd wir mit Elektronenbeugungsuntersu- chungen und ersten Abbildungs\ersuchen beschiiftigt waren, erhielten wirdurch private Mitteilung Kenni- nis von den schcinen elektronenmikroskopischen Aufnahmen, die Menter ebenfalls mit di-ni ..Elmiskop I" von Pt- und Cu-Phthalocyanin erluiUcn hattc. E.xpcrinicniclh' Eri^'civiisse. — Da man schon aus dem Beugungsbild eines Einkristallcs entnehmen kann. ob Netzebenen dieses Kristalles elektronen- mikroskopisch abbildbar sind, untersuchten wir zuerst die Beugungsbilder von Ni- und Cu-Phthalo- 94 R. NEIDER Abb. 1. a. Elektronenbeugung von Ni-Phthalocyanin. Beugungsliinge: 45, Phthalocyanin. Bcugungslange: 45,1 (mm • A). (mm • A), b. Elektronenbeugung von Cu- cyanin, und zwar wegen der Kleinheit der Kristalle mit der Methode der Kleinfeldbeugung mittels Selek- torblcnde. Abb. I a, h zeigt Elektronenbeugungsdiagramme von Ni- und Cu-Phthalocyanin. Durch Vergleich mit der Rontgenstrukturanalyse von Robertson und Woodward (2. 3) wurden die engsten Refiexe in bei- den Diagrammen als 20T bzw. 201 (9,86 A) und die dazu senkrecht liegenden Refiexe als 110 bzw. 110 (4,65 A) identifiziert. Die beiden Verbindungen Ni- und Cu-Phthalocyanin unterscheiden sich in ihrem kristallographischen Aufbau nur sehr wenig. Beim Cu-Phthalocyanin wurde aber auch noch ein ande- res Beugungsbild gefunden: Abb. lb. Abb. la zeigt die Mikrophotographie von zwei Einkristallen aus Cu-Phthalocyanin, von denen das Beugungsbild aufgenommen wurde. Im Diagramm (Abb. Ih) sehen wir einmal die oben schon gezeigten Reflexe 20T bzw. 201 und 110 bzw. iTO von Cu- Phthalocyanin. Zusatzlich tauchen aber in der Nahe von den Reflexen 20T bzw. 20! noch ein paar enger liegende Refiexe auf, die einem Netzebenenabstand von 12,12 A entsprechen und von dem schmalen Kristall stammen, wie durch Abdeckcn des anderen Kristalls festgestellt wurde. Nimmt man an, daB es sich bei dem schmalen Kristall auch um Cu-Phthalo- cyanin und um die gleiche ModiHkation wie bei den anderen Kristallen handelt, so entsprechen diese Reflexe den 001 bzw. OOl-Netzebenen. Das Erschei- nen dieser Reflexe legt den SchluB nahe, daB der schmale Kristall eine andere Tracht als der breite Kristall besitzt. Auch aus einigen anderen elektro- nenmikroskopischen Bildern ziehen wir den SchluB, daB ftir Cu-Phthalocyanin nicht immer die Tracht vorliegt, wie sie Robertson angegeben hat. Auf anderen Beugungsaufnahmen mit den Reflexen 001 bzw. 001 fanden wir in der senkrechten Richtung dazu Reflexe. die einem Netzebenenabstand von 3,78 A entsprachen und mit 310 bzw. 310 indiziert werden konnen. SchlieBlich wurde bei manchen Cu- Phthalocyaninkristallen noch ein drittes von den beiden vorhergehenden Beugungsbildern verschiede- nes Beugungsdiagramm gefunden: Abb. 3. Dieses Diagramm weist die gleichen Reflexe wie das Diagramm mit der Kombination 001 ,310 auf, aber zwischen den verschiedenen Ordnungen von 001 erscheinen noch zusiitzliche Reflexe. Sie entsprechen dem doppelten Netzebenenabstand, niimlich 22,6 A, und sind mit den bekannten kristallographischen Daten des Cu-Phthalocyanins nicht vereinbar. Die Abb. la, b. Elektronenbeugung von Cu-Phthalocyanin mil dem die Beugung erzeugenden Objektbereich. VergroBerung: 39000. Beugungsliinge 43,1 (mm • Aj. Ahbihlimg von Kiislalli,'itterstniktwen 95 Abb. 3. ElektroncnbeugLing von Cu-Phihalocyanin. Beu- gungslange: 56,5 (mm • k). zusatzlichen Reflexe verschwinden nach gewisserZeit der Elektronenbestrahlung, so daB nur noch die 001 -Reflexe iibrig bleiben. Die entsprechende Er- scheinung konnten wir im elektronenmikroskopi- schen Biid beobachten: Wahrend zuerst Netzebenen mit einem Abstand von 22,4 A abgebildet wurden, halbierte sich dieser Abstand nach 2-3 Minuten, so daB die Netzebenen nun einen Abstand von 1 1,5 A hatten. Die Erkliirung fiir diese bemerkenswerte Erscheinung steht noch aus. Bei der Abbildung der Netzebenen kommt es in erster Linie darauf an, daB die entsprechenden In- terferen/strahlcn bei der Abbildung mitwirken und nicht durch die Aperturblende abgefangen werden. Eine Aperturblende von 50 // laBt in den Diagram- men von Abb. 1 «, h und Ih jevvcils die I. und 2. Ordnung von 20T bzw. 201 und 00! bzw. 00!" durch. In Abb. 3 werden auf jcdcr Seitc vom Nullstrahl fiinf von lAcu cng liegcnden Rellexen durchgelassen. Zur Kontrolle wurde vor den Aufnahmen jeweils das Bcugungsbild der Kristalle betrachtet. In Abb. Aa, h, c sind 20T-Netzebcncn von Ni- Phthalocyanin mit einem Abstand von 9,8 A, 001- Netzebenen von Cu-i*hthalocyanin mit einem Ab- stand von 11,5 A und Netzebenen des Cu-Phthalo- cyanins mit 22,4 A Abstand zu sehen. Die Kristalle wurden durch Sublimieren an Luft hergestelll und in Alkohol oder Ather suspendiert. Fiir die Abbil- dung wurden 7-Loch-Blenden mit graphiticrten Kol- lodiumfolien, die vorher im Elektronenmikroskop einer intensiven Elektronenbestrahlung ausgesetzt wurden, oder netzartig aul'gerissene Formvarfolien benutzt, so daB die Kristalle an Stellen abgebildet werden konnten, an denen sic iiber ein Loch ragten, und so der Folienuntergrund nicht storte. Aufge- bracht wurden die Kristalle durch Verneblung der Alkohol- oder Athersuspension mit 3 MHz Ultra- schall. Bei den Aufnahmen wurde mit Riicksicht auf mciglichst geringe Erwiirmung meist nur ein kleiner Objektbereich mit dcm Feinstrahlkondensor durch- strahlt. Um bei der Beobachtung und Aufnahm.e un- mittelbar vom Bcugungsbild zum mikroskopischen Bild mit aufgelosten Netzebenen iibergehen zu kon Abb. 4. a. 20T-Netzebenen (9.8 A) von Ni-Phthalocyanin. VcrgroBerung: 2 600000. cicktroncnmikroskopisch: 150000. b. Netzebenen von Cu-Phthalocyanin (11,5 A Abslantl). VcrgroBerung: 2 600000, elekironcnmikroskopisch: 150000. c. Netzebenen von Cu-Phthalocyanin (22.4 A Abstand). VcrgroBerung: 1 300000, elcktronenmikroskopisch: 39000. Abb. 5rt, b. Elektronenbild eines Einkristalls aus Cu-Phthalocyanin. Stereopaar stand: 11,5 A. VergroCerung: 750000, elektronenmikroskopisch: 150000. mit Stereowinkel < 3°. Netzebenenab- Ahhildimg von Kristallgitterstrukturcn 97 nen, vvurde die Schaltung des Elmiskop I abgeandert. Der Kondensor K 1 vvurde aus dem Stromkreis des Mikroskops herausgenommen, durch cine unabhan- gige Spannungsquelle von 120 V gespcist iind mit einem eint'achen Schiebcwiderstand eingestcllt. Es wurde bei moglichst schwachen Intcnsitatcn am Objekt (10"^ A cm- - 10^* //A /<-) gearbeitet, wcil die Kristallage sonst nicht stabil genug war oder die Kristalle gar verdampftcn. Die Aufnahmen vviirdcn auf Kranz-Feinkorn-Platten (15 10 DiN) mit Be- lichtungszeiten von 1 min gemacht. Ahbildimg der Netzebencn hci Ahweichimg vom Bragg-Winkel. — Wir untersuchten weiterhin die Frage, wie weit dcr Winkel zwischcn Netzebene und einfallendem Strahl abweichen darf, ohne dali der Kontrast in der Abbildung der Netzebenen allzu stark abnimmt. Ein Cu-Phthalocyanin-Einkristall, dessen 001 -Netzebenen sich in Interferenzstellung befanden. wie mit Hilfe der Kleinfeldbeugung fest- gestellt wurde. wurde bei 1 SOOOOfacher VergroBerung photographiert. Dann neigten wir das gesamte Prii- parat mit der Stereoeinrichtung urn 3 . Der Kipp- winkel um eine Achse parallel zu den Netzebenen betrug daher keinesfalls mehr als 3 , wahrscheinlich sogar weniger. Nach dieser Neigung wurde der Kristall noch einmal photographiert (Abb. 5a, h). Man erkennt auf dem oberen Bild, daB die Netz- ebenen nur in einem Teil des Kristalles mit hohem Kontrast abgebildet werden. Auf dem unteren Bild hat sich der Bereich, in dem die Netzebenen mit hohem Kontrast abgebildet werden, verlagert. Dar- aus muB geschlossen werden, daB der Kristall ver- bogen Oder geknickt ist. In einem Bereich des Kri- stalls, der sich dem Gebiet guter Abbildung der Netzebenen anschlieBt, erkennt man auf beiden Bil- dern eine Kriimmung von Netzebenen und Unregel- miiBigkeiten im Gitter. An dieser Stelle liegt ofTen- sichtlich der Knick im Kristall. Die Bilder beweisen, daB die Abbildung der Netz- ebenen schon bei einer Abweichung von etwa 3" vom Bragg-Winkel fast ganzlich verloren geht. Men- ter (I), der sich experimentell und theoretisch eben- falls mit dieser Frage beschaftigt hat, kommt zu dem Ergebnis, daB die Intensitiit des Interferenzstrahls 20T erstmals bei 1 ,2' Abweichung vom Bragg-Winkel fiir 600 A Kristalldicke und bei 100 A Kristalldicke erstmals bei 7 Abweichung vcrschwindet. Daraus darf man unserer Meinung nach nicht den SchluB Ziehen, daB die Netzebenen bei einer Neigung von 7" gegen den Primarstrahl noch mit genugend hohem Kontrast abgebildet werden, wenn nur die Kristall- dicke klein genug ist. Unsere Berechnung der Inter- ferenzintensitat bei optimaler Kristalldicke crgibt bei einer Abweichung von 2,5 vom Bragg-Winkel einen Abfall der Intensitat auf weniger als 4 "o des Maxi- malwertes, bei 10 auf 0,1 "„. Da dcr Bragg-Winkel 0,5 ist, muB angenommen werden, daB bei Abbil- dung der Netzebenen diese annahernd parallel zum Primarstrahl liegen. Die Tatsache, daB die sehr dunnen Kristalle ver- bogen oder geknickt soin konnen und so nicht iiber den gesamten Bereich des Kristalles die gleichen Interferenzbedingungcn erfiillt sind, erkliirt auch das gleichzeitige Erscheincn dcr Rcflcxc 20T und 110 in den erstcn beiden Bcugungsbildcrn, die wir sahcn. Bei einem unverbogcnen Kristall vviire dies niimlich gar nicht moglich. Es muB daher angenommen werden, daB die 20T- und 1 10-Netzebenen des Ni- oder Cu-Phthalocyanins nicht glcich/eitig an dcnscl- ben Stcllen des Kristalls rcUckticren, sondern wegen einer Vcrbiegung oder Knickung des Kristalls an verschiedenen Stellen, die aber immer noch im Bereich des zur Beugung gelangenden Objektfeldes liegen. Thcorctisclw Ergchnissc. — Um wcnigstens einen groben qualitativen Vergleich dcr experimentellen Ergebnisse mit der Theorie durchfiihrcn zu konnen, wurden die zu erwartende Dichtevcrteilung des Elek- tronenstroms an der Strahlaustrittslliiche eines Ni- Phthalocyanin-Einkristalls untcr folgenden verein- fachenden Annahmen nach dcr dynamischen Theo- rie berechnet. 1. Absorption und inkoharentc Streuung werden gegeniiber der kohiirenten Streuung vernachliissigt, weil es sich um eine sehr diinne Schichtdicke handelt. 2. An Stelle des Ni-Phthalocyanin-Molekiils werden im Kristallgitter je ein Ni-Atom angenommen. denn obwohl die Kohlenstoff- und StickstofTatomc alle zusammen ein groBeres Streuvermogen gcgenCibcr der Elektronenstrahlung haben als ein einziges Ni- Atom, wirkt sich dieses nicht so stark aus, weil sie auf einen viel groBeren Raum verteilt sind und sich daher wahrscheinlich erst bei Interferenzen hoherer Ordnung bemerkbar machen. 3. Wiihrend im Mikroskop erst durch die Apertur- blende alle Interferenzstrahlen bis auf die 1. und 2. Ordnung von 20T kiinstlich zu Null gemacht werden. setzen wir voraus, daB nur die Inlerferenzstrahlcn D --588 (980) S D-39Z(H76)S D--m(i372) 4 D-0(-f5b8)A — X — ^ iO ^ Abb. 6(/. Intensitatsverteilung der Eleklronenstrahldichtc in dcr Austrittsflachc cincs Ni-Phihalocyanin-Einkristalls fiir verschiedene Kristalldickcn (.theoretisch). i I Abb. 6/?. Experimentelle Kurve, gewonnen durch Photo- meirierung senkrechi zu den 20l-Netzebenen des Ni-Phthalo- cyanins im Negativ. 7 — 568204 Electron Microscopy 98 W. D. RIECKE 20T und 201 auftreten. Dabei werden die entsprechen- den Interferenzstrahlen 2. Ordnung vernachlassigt, die oft sehr schwach sind und, wie experimentell festgestellt werden konnte, fur die Abbildung von Netzebenen nicht unbedingt notwendig sind. Abb. 6 a, h zeigt das Ergebnis der Rechnung fiir eine Einstrahlung parallel zu der Netzebene 20T zu- sammen mit einer experimentellen Kurve, die durch Photometrierung des Elektronenbildes von_ Ni- Phthalocyanin senkrecht zu der Netzebene 201 ge- wonnen wurde. Aus den theoretischen Kurven, die fiir die Inten- sitiitsverteilung verschiedener Kristalldicken gelten und dabei gleichzeitig ein anschauliches Bild der Anderung der Intensitatsverteilung beim Fortschrei- ten durch den Kristall liefern, ersieht man, daB der Kontrast, mit dem die Netzebenen abgebildet wer- den, in dieser Naherung eine periodische Funktion der Kristalldicke ist. Weiter folgt daraus, daB die Netzebenen bzw. Potentialmaxima in diesem speziel- len Fall sich im Bild nicht an den Linien minimaler, sondern genau an denjenigen maximaler Intensitat befinden. SchlieBlich sehen wir als wesentlichstes Ergebnis der Rechnung, daB zwischen zwei Intensitatsmaxima an den Stellen der Netzebenen jeweils noch ein wei- teres schwaches Maximum auftaucht, das von der Uberlagerung von 20T und 201 herriihrt. DaB wir dieses im Experiment nicht sehen, ist kaum durch eine ungeniigende Naherung der Theorie erkliirbar, sondern durch eine ungeniigende elektronenmikro- skopische Auflosung oder Fokussierung. Herrn Prof. Dr. E. Ruska danke ich fiir die Anregung und Ermoglichung dieser Arbeit sowie fiir sein forderndes Interesse. Herrn Dr. H. Niehrs verdanke ich zahlreiche anregende Diskussionen und Hinweise. LiTERATUR 1. Menter, J. W., Proc. Roy. Soc. A 236, 119 (1956). 2. Robertson, J. M., J. Chem. Soc. 1935/1, 615. 3. Robertson, J. M. und Woodward, I., /. Chem. Soc. 1937/1,219. Investigation of High Resolution Electron Diffraction Patterns from Individual Micro-Crystals by Using a Three-Stage Electron Microscope W. D. RiECKE Fritz-Haber-Imtitiit der Max-Planck-Gesellschaft, Berlin-Dahlem Besides the visual examination of individual sub- microscopic crystals in bright and dark field micro- graphs, the observation of their diffraction patterns will be of interest. As is well known, the chemical nature or the lattice structure of the crystal can be determined under favourable experimental condi- tions. Moreover, as will be shown in this paper, diffraction experiments in the submicroscopic region may be carried out by combining micro-diffraction and high resolution diffraction. Apart from the dif- fraction pattern, shape, size, and orientation of the scattering crystal may be visually observed on the final screen. It thus became feasible to examine the fine structures at the undiffracted beam, which had hitherto escaped observation. For an interpretation of the diffraction effects, the defocused diffraction pattern may furnish valuable clues. Electron diffraction patterns of small specimen areas. — Up to now, three methods have been em- ployed to produce electron diffraction patterns of small specimen areas: (i) v. Ardenne (1) used a small stop, 6 n in diameter, which he placed just above the specimen. Thus, the area irradiated by the con- denser lens was limited to this size, (ii) v. Ardenne and co-workers (2), Hillier and Baker (4) as well as Ruska and Wolff (11) produced a considerably de- magnified image of the electron source in the plane of the specimen. They obtained illuminated areas of the order of 1 //. (iii) Boersch (3) placed an aperture of a diameter D in the plane of the first-stage image of the specimen. Thus, all the rays were screened except those emanating from an object area d = D'M in diameter. Here M is the magnifica- tion of the objective lens. The experiments to be carried out required the production of high resolution diffraction patterns of specimen areas about 1 /t in diameter. Moreover, the scattering region had to be identified precisely by visual observation of the final screen or examina- tion of the electron micrograph. Method (iii) seemed to be the best suited for this purpose. The reasons are as follows: With method (i) v. Ardenne (1) used stops of very small diameter, which contaminate rapidly. Apart from this, it is mechanically difficult to obtain well rounded bores less than 5 // in dia- meter. Ruska and Wolff (11) (method ii) employed a double condenser to obtain a demagnified image of the cross-over in the specimen plane. The angle of illumination in this plane is kept low by inserting small-diameter stops into the bore of the second con- denser lens. A diffraction resolution of 500 to 1000 can be obtained with this arrangement. Unfortu- Hii^'li Resolution Electron Diffraction Patterns from Microcrystcils 99 ELECTRON SOURCE APERTURE FOR CONDENSER LENS 1 nPERTURE FOR CONDENSER LENS 2 SPEC/MEN OBJECTIVE LENS OBJECTIVE APERTURE DIFFRftCTION PATTERN FIRST-STAGE IMAGE — OF SPECIMEN SELECTING APERTURE INTERMEDIATE LENS FIRST-STAGE IMAGE OF DIFFRACTION PATTERN SECOND -STAGE IMAGE " OF SPECIMEN. APERTURE PROJECTOR LENS SECOND -STAGE IMAGE OF DIFFRACTION PATTERN FINAL SCREEN AND PLATE BRIGHT-FIELD IMAGE O^ERFOCUSED FOCUSED UNDERFOCUSED DIFFRACTION PATTERN DIFFRACTION PATTERN DIFFRACTION PATTERN ft B C D Fig. 1. Ray paths in high resolution micro-diffraction. nately, the scattering area cannot be located with sufficient accuracy, as, in order to procure the diffraction pattern, the objective lens current is cut off. Due to this, the stray magnetic fields between the second condenser and the specimen are reduced. These had previously caused a slight deflection of the illuminating beam, and thus a displacement of the image of the electron source relative to the undis- turbed position by a distance large against its own dia- meter. Now, the deflection is equally reduced, which also reduces the displacement of the image of the source, and the identity of the scattering area with the selected field of the electron optical image is lost. This effect may only be overcome by a tedious and elaborate adjustment of the microscope, the success of which is not guaranteed. The arrange- ments of V. Ardenne and co-workers (2) and of Hillier and Baker (4) only permit shadow-microscopic ob- servation of the specimen and moderate diffraction resolution (R ^ 150). Experimental arrani^'cnients and teclniic/iie. — We have used an electron microscope type "Elmiskop 1" of Siemens & Halske AG (11). Objective lens and intermediate lens are operated independently. The diameters of the apertures selecting the specimen field, which are situated just above the intermediate lens, were chosen as to permit the examination of areas 2.2 and 0.9 /< in diameter. A diagram of ray paths is given in fig. I. The precision of the repro- duction of the camera length (57.5 cm) in routine operation has been discussed (10). For high resolution diftYaction work, a small angle of illumination is indispensable. This was realized by using the first condenser lens to obtain a 50 times demagnified image of the electron source (fig. 1, B, C, D). The lens was fed by a 220 V battery, as its feeding by the microscope power supply is not pro- vided when the intermediate lens is operated inde- pendently. This was feasible, because the require- ments regarding current stability are not stringent for demagnitication work. With the second ctinden- ser lens operating at a very long focal length, the angle of illumination is 5 10" rad, giving a dif- fraction resolution of 8350 at 80 kV. To obtain elec- tron optical images on the final screen, which are sufficiently bright for visual observation, the angle of illumination was enlarged by increasing the current of the second condenser lens (fig. 1, A). Axial astigmatism of the intermediate lens is detrimental to the diffraction resolution (10). When 100 W. D. RIECKE e G ft Fig. 2. Fine structures in tlie undift'racted beam in the diffrac- tion pattern from individual MgO crystals, (b) Pattern from the crystal shown in (a), and (d) that of the crystal (c). (H.T. = 80 kV.) this lens was used to form an image of the diflFraction pattern, existing in the back focal plane of the objective lens, within the object plane of the projector lens, it had a focal length of 4.8 cm and an astigmatic difference of focal lengths of 0.02 cm. This limits the diffraction resolution to /? 1 120 d, which shall be discussed in detail elsewhere, d is the diameter of the selected specimen area in /(. As to the resolution of fine structure in a reflection, the first-stage image of the scattering crystal practically acts as the aperture for the intermediate lens. The other rays, which pass the selecting aperture, do not contribute to this reflection. Even for a crystal size of I /*, an adequate resolution R ^ 1100 may be expected. Under these conditions, astigmatism and spherical aberration of the objective lens have no detrimental influence on the diffraction resolution. Apart from bright-held images or dark-field images taken with definite reflections, defocused diffraction patterns are useful for the interpretation of the focused ones (fig. 1, B, D). The overfocused dif- fraction pattern may be considered as a pin-hole projection of the second-stage image of the specimen onto the final screen. The "pin-holes" are formed by the reflections in the second stage image of the diffraction pattern (fig. 1 , B)_ At this, the undiffracted beam produces a "bright-field" shadow image, and each reflection a corresponding "dark-field" shadow image. In a similar way, the underfocused diffrac- tion pattern may be regarded as a point-projection image of the second-stage image of the specimen. The projecting rays emanate from the reflections of the first-stage image of the diffraction pattern (fig. I, D). The shadow images in the underfocused diffraction pattern are correctly orientated to the focused one, apart from a slight rotation corres- Fig. 3. Focused (a) and overfocused (b) diffraction pattern as well as micrograph (c) of an individual MgO crystal. (H.T. = 80 kV.) ponding to the defocusing of the intermediate lens. Those of the overfocused pattern are rotated with respect to the focused one by 1 80\ Experimental results. — We have examined the dif- fraction patterns of MgO and ZnO crystals. The specimens were prepared by burning magnesium or zinc ribbon and exposing platinum specimen carriers to the smoke. Although the holes of the carriers were not covered by the usual collodion film, in order to avoid additional scattering, a great number of perfectly grown crystals were found to adhere to the rim of the holes. First, we looked for those types of fine structures that are predicted by the dynamical theory of elec- tron diffraction. In the diffraction patterns, that had been published hitherto, the fine structures in the undiftYacted beam were masked by the well-known extensive spot of intense halation, which is caused by the superposition of the scattered intensities of a great number of crystals. This effect was eliminated with our method by producing diflVaction patterns of only one crystal. In the undiffracted beam of the patterns of individual MgO crystals we have ob- tained fine structures., which are caused by interference double refraction, provided that strong Bragg reflec- tions occur (fig. 2, b). This has been predicted by Moliere and Niehrs (7). At longer exposure times, even more weak spots are found on straight lines drawn through the doublets corresponding to each crystal wedge. A great number of spots is obtained with relatively large crystals some 1000 A in size (fig. 2, d). By using the selecting aperture to screen the first-stage image of the crystal, with the exception of a single wedge-shaped part at an edge of the MgO cube, the figure is reduced to (i) the double- refraction doublet, and (ii) some weak spots on the High Resolution Electron Diffnulion Patterns from Mierocrystals 101 Fig. 4. Fine structures in the dilTraction pattern from indi- vidual ZnO crystals, (b) Undeflected beam in the difl'raction pattern of the crystal (a), (c) Central beam with fine struc- tures, and (d) reflection with subsidiary maxima from other patterns. (.H.T. = 80 kV.) Straight line drawn through the doublet. These spots are deviated to larger angles than the doublet itself. Their intensity is two to three orders of magnitude lower than the intensity of the doublet. As the inter- ference figure observed is frequently not symmetric to the center of the diagram, the effect cannot be interpreted as an extension of the reciprocal lattice point (5) or as Fraunhofer diffraction. In both cases, the crystal size obtained from the micrographs would result in spots of much narrower spacing than that found in the diffraction pattern. In our opinion, the weak spots may be caused by beams belonging to further wave fields disregarded in interference double refraction. Some fine structures in (hkO) reflections from MgO crystals are most probably subsidiary maxima, caused by the extensions of the scattering amplitude around each reciprocal lattice point, which arc nor- mal to the boundary faces of the crystal. The fine structure shown in fig. 5, a, corresponds to a crystal 500 A in cube length. Unfortunately the spherical aberration of the objective lens introduces an uncer- tainty of about 0.1 /< into the exact location of the scattering area when the beams are deflected about larger Bragg angles. Therefore, diffraction patterns of individual crystals of this size cannot be obtained. Nevertheless, the defocused diffraction pattern per- mits an estimation of the upper limit of the crystal size, which is O.I //. The above supposition is thus confirmed indirectly. On defocusing a diffraction pattern, darkfield shadow-images of the scattering crystal regions arc obtained from the strong refiections. In the case of a wedge-shaped part of a crystal, two waves and correspondingly two rays are present for each rellec- tion. Therefore, in the overfocused pattern, two Fig. 5. (a) Subsidiary maxima and (b), (c), (d) ne\s t>pcs of fine structures in diffraction patterns from MgO crystals. In (c) and (d) each spot of a quartet is split up into two spots. close lying shadow images of the wedge are ob- tained for each strong reflection (fig. 3). This may be regarded as a "double" projection of the second- stage image of the wedge, produced from the spots of the corresponding double-refraction doublet, which appears in the second-stage image of the dif- fraction pattern. In the diffraction patterns of individualZnO crys- tals, fine structures in the undifTracted beam have also been observed (fig. 4, a, b, c). Contrary to the subsidiary maxima, which are found at Bragg rctlcc- tions (fig. 4, d) and have already been obtained (8). they are not symmetrical to the center of the pattern. For an interpretation of the effect, it is most prob- able that the dynamical theory of electron diffraction will have to be considered. Finally, some other diffraction effects were ob- served, which have not been interpreted up to now (fig. 5, b, c. d). The splitting up of each spot of a double refraction quartet into two spots occurs rather frequently, and has also been obtained by Molicre (6). References 1. VON Ardenne, M., Kolloid-Z. 108, 195 (1944). 2. VON Ardenne, M., Schiebold, E., and Gunther, F., Z. Pliysil< 119, 352 (1942). .V BorRsni, H., .)/;/;. Pliysik (5) 27, 75 (1936). 4. Hill II R. J. and IUktr. R. I-.. J. Appl. Plivs. 17, 12 (1946). 5. VON Laue, M.. Ann. Physik (5) 26. 55 (1936). 6. MoiiiRi', K., personal communication (1956). 7. MoLiERE, K. and Niehrs. H.,Z. Physik 140, 581 (1955). 8. Rees, A. L. G.andSpiNK. J. A.,/fc/fl C/-v.vr. 3, 316 (1950). 9. RiECKE, W. D., P/n.s. It'///. (2) 6. 20 (1955). 10. RinrKE,W. D. and Rlska, E., Z. h/.v.v. Mikroskop.{\951, in press). 11. Rt_SKA. E. and Wni rr. O., Z. u/.v.v. Mikroskop. 62, 465 (1956). An Electron Microscope Examination of Freshly Prepared Silver Iodide Sols R. Ottewill and R. W. Horne Dept. of Colloid Science and Cavendish Laboratory, University of Cambridge Although silver iodide, which forms a typically hydrophobic sol. has been extensively investigated in the field of colloid chemistry, very little research has been devoted to an examination of this material in the electron microscope. Of the numerous hydro- phobic sols which can be prepared the gold sols are the only ones to have received any considerable attention by this method, primarily as standards of resolution. In connexion with other physicochemical work on silver iodide sols, this material has been examined in a high resolution electron microscope. Numerous small particles of the order of 10 to 25 A have been resolved and particles of below 10 A have been detected. Since the resolution of such particles is of extreme interest in the field of electron microscopy and colloid science and probably con- stitutes the first resolution of colloidal particles ap- proaching atomicdimensions, it is thought worthwhile to submit a preliminary report of the work at this stage, although a more extensive investigation is still in progress. 100 ml of a solution of silver nitrate (1.25 mM) were added with continuous stirring to 100 ml of a solution of potassium iodide (1.38 mM). The silver iodide sol formed under these conditions is a nega- tively charged sol, stabilized by the adsorption of I~ ions. The sol was freed from potassium nitrate formed during the reaction and from excess potassium iodide by continuous electrodialysis against distilled water. During this process the K^ gegenions are removed to give a sol which may be represented as (Agl) I H^ (1). The sol obtained after electrodialysis was diluted with an equal volume of distilled water to give a concentration of ca. 0.3 mmoles of silver iodide, and used at this strength for the preparation of the electron microscope grids. Silver iodide sols are reasonably stable to daylight, but specimens were always stored in the dark, as a precautionary measure. Distilled water was always treated before use with an ion-exchange column to remove any remaining ions, and both reagents were recrystallised from this water. All glass ware was steamed for half an hour before use to remove any adhering grease film. The sol was freshly prepared in order that aging phenomena, a process which includes possible chan- ges in the form of the particles and changes in the size of particles owing to recrystallisation or slow flocculation, should not become important. How- ever, only a small change in the mean diameter of a silver iodide sol after aging is found (2). An examination of silver and silver iodide sols in the electron microscope at instrumental magnifica- tions of 40,000 and 80,000 revealed the presence of a large range of particle sizes from ca. 180 A down to particles which were only just resolved by the microscope in the range of 6-10 A. Only such particles were measured which were clearly resolved from the background structure and capable of being produced on separate electron micrographs. A preliminary analysis of diameters of 300 particles from a 400,000 times enlargement gave a distribu- tion curve giving a mean particle diameter of 25 r; 5 A. The fact that the solubility of silver iodide is very small, 5 10"' mmoles litre compared with 0.3 mmoles litre present in the sol form, suggests that the small particles are colloidal in nature and are not formed during the drying down process by crystallisation of the silver iodide in molecular solu- tion. The shape of the silver and silver iodide particles in the electron micrographs appear to take many different forms. In the present work particles having a cubic face of side of 25 A have been clearly resolved, also hexagonal particles are visible in the 50 A region, whilst the larger particles (125 A upwards) appear to be either approximately spherical or have irregular shapes. The formation of a colloidal particle is almost certainly that of rapid growth from a nucleus, the latter consisting of only a few atoms, and it is possible Fig. 1. Electron micrograph of silver iodide sol. Instrumental magnification 80.000. Final magnification 500,000. Examination of Freshly Prepared Silver Iodide Sols 103 ^^^^^^^^^^^^r^^ -A ' ■" 1M W^M ^^^K^^^ m ^^B ^^^^E ' % If l^l ^^■^K'f ^^^^H ' * •^^^^1 ^^^^' « * ^ ^^^1 ^Kki^m * » ^[^1 ^^^^^^^ 1 v^H ^^^^^■| . ^^^H ^^^^^^^^B ** t- « «^^^B ~v.- • • f i«- ft #fH * ft /OOO 4 r n .^ Fig. 2. Electron micrograph ofsilversol. Inslrumenlal magni- fication 40,000. Final magnification 400,000. that the state observed here is that of a large number of small nuclei which may eventually grow to larger particles. It is of interest to determine whether such particles disappear during the aging process or to some extent remain in "equilibrium" with the larger particles. The irregularity of many of the larger particles may to some extent be attributed to the angle at which the particle is resting on the supporting film and, or alternatively, to irregular growth during formation. A serious limiting factor in determining the size and shape of particles below 10 A is the presence of background eflfects due to supporting films and also optical effects caused by focusing. The relationship between the true crystal structure and the form of particles observed in the electron microscope is not easy to interpret because of the "shadowing" eff"ect which occurs. However, it is of interest that J. J. Trillat and A. Laloeuf (3), in the electron diffraction study of silver iodide smokes, found that the particles present existed in both hexagonal and cubic crystal forms. The unit cell of the hexagonal form had the dimensions, r 7.94 A. a = 4.58 A, and the unit cell of the cubic form had a = 6.47 A. It thus appears possible that colloidal silver iodide exists in both crystal forms, a fact which is being further investigated by micro-diffraction techniques where it is possible to select areas down to 5 /< diameter. The presence of very small particles in the sol shows clearly the fact that colloidal particles may exist in size almost down to the range of atomic dimensions, and indicates that there is no strict boundary between atomic and colU)idal particles. The distribution of particles of very small size also appears to extend much further than had been rec- ognised hitherto using electron microscopes with a resolution of the order of 30 A. Comparison of silver with silver iodide sols strongly suggests that the dense scattering material is probably silver. The mean diameter of the particles in a colloidal solution is an important factor in colloid chemistry, and its accurate evaluation essential for correlation between experiment and theory. The presence of such a magnitude of small particles may mean that hitherto, where the electron microscope has been used for the evaluation of size, the mean value has been too high because the smaller particles have been unresolved. The theory of Verwey and Over- beek (4) predicts that small particles of diameter ca. 20 A should have a very low stability, since they would require very high electric potentials (H'*,,), and have low absolute values of repulsive poten- tial energy. The latter is directly proportional to particle radius. The fact that particles of this size have been shown to exist in such profusion in the present work does indicate, however, that the prepara- tion of very small colloid particles in a stable form is by no means impossible. References 1. DE Bruyn, H. and Troklsira, S. A., Kolloiil-Z. 84 192, (1938). 2. Harmsen, G. J., VAN ScHOOTEN, J., and Overbeek, J. In. C, J. Colloid Sci. 8, 64 (1953). 3. Trillat, J. J. and Laloeuf, A., /. Chim. P/nw. 46, 168 (1949). 4. Verwey, E. J. W. and Onerhlik, J. Th. G., Thoor> of the Stability of Lyophobic Colloids. Elsevier, 1948, 170-178. V SPECIMEN PREPARATION TECHNIQUES IN BIOLOGY AND MEDICINE Problems of Osmium Fixation G. F. Bahr, G. Bloom and U. Friberg Institute for Cell Research and Genetics, and Department of Histology, Karolinska Institutet, Stockholm During fixation and subsequent treatment in va- rious fluids great changes in volume of tissue speci- mens may occur. To our knowledge no measure- ments have been reported on the changes of volume during osmium fixation and following embedding according to the general technique applied for elec- tron microscopical specimens. We have therefore considered it justified to present the results of quan- titative measurements on the changes in volume, weight, and specific weight during this procedure. The experimental method was based on the prin- ciple of Archimedes. For the weighing arrangement an analytical balance with a sensitivity of 0.1 mg was used. Mostly small pieces of guinea pig"s liver weighing 150-200 mg served as test objects. Other tissues were used for the sake of comparison. A measuring group was comprised of at least 5 speci- mens. Fixation, dehydration, and methacrylate infil- tration were carried out at or 24 C, whereas pa- raffin infiltration was performed at 58'"C. Fig. I shows the changes which occur during fixa- tion in 1 % osmium tetroxide in isotonic Tyrode's solution at pH 7.2 over a period of up to 24 hours. A marked and rapid swelling is seen which reaches a maximum of 30 % after 4 hours. Half of the final value is reached after only 15 minutes in the fixative. The weight curve follows closely the volume curve and therefore only the volume curves will be referred to. The specific weight rises during fixation as an expression of the binding of osmium in the tissues. Changes during the continued preparation are disclosed in fig. 1. The swelling that takes place in the fixative is now transformed — during dehydra- tion — into a shrinkage that almost brings the volume back to the original value. During paraffin infiltra- tion further shrinkage is noted, especially in speci- mens that were fixed at C. Methacrylate, on the other hand, causes only a small shrinkage during infiltration, and can in this respect be regarded as a more favourable medium. During polymerization, however, methacrylate reduces its volume by 20 % — just as does paraffin during solidification — and it seems that this shrinkage is more or less completely transferred to the specimens, as far as we can judge from planimetrical observations on embedded liver pieces. Fig. I also shows that for methacrylate treated specimens the fixation temperature is of httle influence on volume. The specific weight that rises during the fixation falls during dehydration and finally rises again during infiltration. In another experiment a comparison was made between various tissues (fig. 2). Certain differences in intermediate and final values are to be noted. The principal pattern is, however, the same for all tissues. The swelling seen during osmium fixation, is in no way unique for this fixative. In a series of formaldehyde concentrations, ranging from 0.5 to 16 % there is a swelling in all solutions, the magni- tude of which is related in inverse proportion to the concentration of the fixative. Maximal swelling is 140 12. 48 24 S6 ETHiNOL I OSMIUM FIXATION I I I EMBEOOINO TYROOE HOURS I 12 24 36 IethanolI • 10 CO 5 o > (/) X 3) m 10 60 n HOURS Fig. 1. Volume changes of pieces of tissues during osmium fixation and embedding. I -OSMIUM FIXATIONjI^^r MET>1ACRYLATt | 2 fTrRooSl Fig. 2. Volume changes of pieces of various tissues during osmium fixation and embedding. Lipids and Osmium Fixation 107 I UJ ^ 51.0 o UJ a. l4S 120 "'lOO -C— ^ J PiRAFFlN r-' ! ^ ■ L MeTHACHYLATE UJ 2 D _|90 > 24° C \ MtTMACHTUlTE A A VOLUME \ 60 _. _ SPECIFIC • EIGHT \ PARJtFFIN 40 (/> s 10 rn f- r; ^ r •- m i> JO 10 I 4X P0B»1»I-0EMY0C I JIBS ETH«NOL ■I KREBS-IVMCR eo I EUBEODINO HOURS Fig. 3. Volume changes and variations in specific weight of pieces of tissues during formol fixation and embedding. 120 o 100 > 80 1% OSMIUM TET/IOXIDC IN TYRODE WITH ADDITION OF DEXTSAN (Ox) (AND SUCROSE) 0% 3% Dx Dx Dx 12 % Dx 3 % Dx + _ 0.2 M sucRoa 3 % Dx ♦ OSM SUCROSE 6 % Dx ♦ 0^5M SUCROSE o°c 1 24 HOURS to — > I z > (D Fig. 4. Balancing of the volume changes of pieces of tissues during osmium fixation when adding dextran and sucrose to the osmium tetroxide solution. reached in 3 hours. Thereafter a shrinkage can be observed, the speed of which is not related to the concentration. If formalin fixed specimens are followed further in the preparation procedures it is seen (fig. 3) that they react in a manner very similar to that described for osmium fixed material. Fixation in 4 "o formal- dehyde gives an initial swelling of 18 % after 12 hours. Dehydration and paraffin infiltration reduce the volume with 30 "o each. In methacrylate again, the shrinkage is small. The changes in specific weight are unimportant. The results obtained indicate that the swelling in the fixatives is due not only to the fixing agents themselves but in a high degree to the aqueous media in which they are dissolved. Liver pieces were suspended in Tyrode's solution of various concentra- tions at C. A swelling is noted in all, even those strongly hypertonic. As expected the swelling is most pronounced in the diluted solutions and in these, maximal swelling is also reached in shorter time. Similar results are obtained with Krebs-Ringer media and also with sucrose solutions. The addition of small amounts of gelatin to physiological fluids has been recommended in order to reduce their toxical effects on cells. The addition of 0.25 °(, gelatin to Tyrode's solution reduces the swelling significantly with about 20%. Fig. 4 shows that a still more pronounced effect is noted with dextran. It is possible to use dextran in much higher concentrations than is possible with gelatin without increasing the viscosity to an im- practical point. It is also seen that by combining dextran with sucrose it is possible to completely prevent the swelling. The next question of great interest is if it is possible to reduce the shrinkage during dehydration to some extent. Dehydration in rising concentrations of ethanol brings about a more gradual shrinkage than absolute ethanol, but the end result is but little better. In the literature various substitutes for ethanol as dehydrating agent have been proposed. From our results it is obvious that only methanol appears to give better results than those obtained with ethanol. The Quantitative Assay of Lipids Extracted from Untreated and Os04-fixed Beef Brain G. F. Bahr Institute for Cell Research and Genetics, Karolinska Jnstitutet, Stockholm Although we know today where osmium cannot be expected to be found in a thin section, we really know little about the actual places of osmium reac- tion and deposition (1, 2). There has been much dis- cussion about to what extent osmium is bound by the different constituents of a tissue. Now the main interest is focussed on the question whether the lipids or the proteins are demonstrated by osmium deposits. Our recent analyses show that osmium fixation renders a fraction of about 2 "„ of the total dry weight unextractable in the \ovm of lipids (fig. I). Skin 108 I. R. GIBBONS AND J. R. G. BRADFIELD BRAIN-TISSUE EXTRACTABILITY D Ffesh motenol ■ Os(X - filed moleriol obviously makes an exception in this series, because extractability is considerably increased. An explana- tion would be that here the fixation has opened up the tissue and rendered the lipids accessible for extraction. The 2 "^'o lipids bound by the osmium fixation must consist of unsaturated compounds. In rats fed with a diet containing 5 °o fat, about 70 °o of the tissue fatty acids are unsaturated (3). Mammalian fat has as a rule an iodine number of 65 corresponding to a total capacity to bind 0.47 g Os per gram fat. With regards to the fact that only 70 % of such fat is actually unsaturated, we calculate the osmium up- take by the unsaturated fat fraction to 0.63 g osmium per gram. Ten per cent fat can ordinarily be extracted from tissues, which means that 100 g tissue dry weight has a maximal capacity to bind 4.7 g osmium by its lipids. Our analysis showed that maximal uptake values for liver tissue were about 15 g osmium per 100 g tissue dry weight. Thus the uptake exceeds the theoretical capacity of the tissue lipids by |. In other words, a considerable part of the osmium is bound by substances other than lipids. Direct analysis shows that but little of the binding capacity of the lipids is actually used. Instead of theoretically possible 4.7 g only 1.3 g are taken up by the lipids in 100 g tissue dry weight. That is 8.4% of the total osmium uptake, (fig. 2.) In consequence neither proteins nor lipids are significantly preferred by osmium. Upon a question by Dr. Sjostrand if there might possibly be a preference of certain compounds in the lipid fraction itself, an analysis of fixed and unfixed brain lipids was carried out. (fig. 3.) Technical de- tails of the rather complicated analytical procedure cannot be discussed here and will be published else- where. To demonstrate preferences of the osmium tetroxide fixation towards certain lipids an amount of osmium tetroxide was added corresponding to about 30 % of the theoretical capacity of uptake. Six per cent lipids have been rendered unextractable but again no real significant preference for one type of lipid could be observed. It may thus be said that osmium tetroxide fixation stains reactive compounds in tissues in even pro- portions, without giving significant preference to certain substances. Unfortunately more cannot be said from this study but that the well-known pattern of repeating dense and light bands in thin sections corresponds to accumulations of reacting and un- reacting groups. References 1. Bahr, G. F., Exptl. Cell Research 7, 457 (1954). 2. — ibid. 9, 277 (1955). 3. Deuel, H. J., The Lipids. N.Y. Interscience Publ. (1951). The Fixation of Nuclei in Locust Testis I. R. Gibbons and J. R. G. Bradfield Cavendish Laboratory, Cambridge Previous studies on the problem of fixation, both with light and electron microscopes, have demon- strated the excellence of buffered osmium tetroxide in the preservation of cytoplasmic ultrastructure (4, 5). This work has been confirmed by the highly organ- ized and highly reproducible ultrastructures observed with the electron microscope in the cytoplasm of cells after osmium fixation. However, with regard to the nucleus the situation is quite different. Little apparently organized ultrastructure has been observed in osmium-fixed nuclei either interkinetic or dividing. In view of this fact we have considered it desirable to re-examine the question of the fixation of nuclei. The chromatin distribution within live nuclei of locust primary spermatocytes has been investigated by observing squashes of testis follicles in Belar solution with an ultra-violet microscope. Nuclei in meiotic prophase cells appear to have their chroma- tin arranged in intertwined strands, the thickness of these strands is variable and increases as the cell approaches diakinesis. When, however, osmium fixed nuclei of this material are examined in electron micrographs of thin sections they usually appear to have a rather homogeneous fine-grained appearance, and show little, if any, trace of the inhomogeneity of chromatin existing in live nuclei. In order to re- Fixation of Nuclei in Locust Testis 109 m 'P- ^ If •4iJ*.V Figs. 1-2. Electron micrograph (2) of a thin section of an osmium fixed nucleus in locust testis with an inset of an ultra-violet micrograph (1) of the same nucleus in an adja- cent thicker section. Two clusters of mitochondria (w) are indicated. They possess considerable ultra-violet absorption. solve this discrepancy, we have examined adjacent thick. (| /<) and thin (about 200 A) sections of osmium fixed testis in ultra-violet and electron microscopes respectively. Low magnification micrographs permit the identification of identical nuclei in the two sec- tions. A comparison between two sections of the same nucleus is shown in figs. 1-2. Fig. I is an ultra- violet micrograph of the thick section and shows that the inhomogeneous distribution of chromatin in the live nucleus is at least partly preserved by osmium fixation. Fig. 2 is an electron micrograph c'f the ihin sectiiMi of the same nucleus, it shows the homogenecHis appearance typical of osmium fixed nuclei in this material and little trace of the inhomo- geneities of chromatin existing in the section is dis- cernible. This homogeneous appearance of nuclei in electron micrographs must, therefore, be ascribed not to the failure of osmium fixation to preserve chromatin distribution, but to its failure to produce appreciable contrast between chromatin and nuclear sap. We believe that this lack of contrast is evidence that osmium tetroxide does nt)l react with desoxyri- bonucleic acid (2). The general appearance of nuclei after osmium fixation is shown in fig. 2. The nucleus shows a rather homogeneous fine-grained structure with little trace of organisation. When examined at high magni- fication occasional traces of organised structure are seen appearing as groups. The general appearance of nuclei after formalde- hyde fixation is shown in fig. 3. The distribution of chromatin within the nucleus is easily visible because the relative contrast between chromatin and nuclear sap is higher than in osmium fixed nuclei. The pairing of the chromosomes during prophase is indicated but the chromosomes still show no apparently highly organised structure. As regards contracted chromo- somes, the contrast between chromatin and cyto- plasm is higher than in osmium lixed material but there is a similar apparent lack of organisation. The chromosomes may appear to possess a split down the centre but the significance of this is hard to interpret because of the difficulty of identifying the stage of meiosis from a thin section. One of the classic fixatives used in light micro- scope studies of chromosomes is 45 ",, acetic acid and we have considered it worth while to examine material fixed in this way in the electron micro- scope. In sections which are not too thin it is possible Fig. 3. Electron micrograph of locust testis fixed in 5 % for- maldehyde. Most of the field is occupied by a primary sper- matocyte nucleus in which the pairing of the chromatids is indicated by the arrow. Fig. 4. Electron micrograph of locust testis fixed in 45 °o acetic acid. The pairing of the chromatids is indicated in transverse section (M) and longitudinal section (N;. 110 I. R. GIBBONS AND J. R. G. BRADFIELD Fig. 5. Electron micrograph of a longitudinal section of a locust immature sperm head fixed in 1 % osmium tetroxide. to distinguish such gross characteristics as pairing of chromatids (fig. 4) both in transverse section (M) and longitudinal section (N). When thinner sections are used in order to obtain higher resolution the poor preservation makes interpretation almost impossible. Sperm and spermatid heads of the locust have been shown by birefringence studies and ultra-violet dichroism studies (1) to contain nucleic acid mole- cules orientated along the axis of the head. It is, therefore, interesting to examine this material in the electron microscope after various fixatives in order to obtain some idea of the value of these fixatives in preserving chromatin fine structure. While we have not as yet been able to demonstrate structure in mature sperm heads, we have observed well defined and characteristic structure in the heads of sperma- tids. This structure in the most highly developed form we have been able to observe is shown in longitudinal section in fig. 5 where it appears as a large number of parallel lines of thickness about 70 A which are orientated along the axis of the head. The corresponding transverse section — which is from the same cyst in the follicle and so must represent the same stage of development — is shown in fig. 6 to be a large number (about 270 in this case) of tightly packed polygons. We interpret these sections to mean that the head contains a large number of parallel tubes orientated along its axis (3). At this stage of development the head is shrinking rapidly and at later stages this structure seems to become too tightly packed to be easily visible and the head appears structureless. At earlier stages of develop- ment we have observed that material first seems to aggregate into sheets and that these sheets then appear to wrap around each other to form the tubed structure described above. Fig. 6. Electron micrograph of a transverse section of a locust immature sperm head in the same cyst in the follicle as that shown in fig. 5 and hence at the same stage of de- velopment. We have observed this structure after fixation in 1 "o buff'ered osmium tetroxide and after 5 % buffered formaldehyde there being little obvious difference in the quality of preservation. We have also been able to observe the structure, though less well- preserved, after fixation in 45 °o acetic acid — a classic but brutal chromatin fixative. It must be admitted that the results of the appli- cation of electron microscopy to the study of nuclei have been somewhat disappointing. In particular no further insight has been gained into the processes of mitosis and meiosis which at the level of the light microscope appear so mysterious and dramatic. It is not yet possible to say whether this is due to poor preservation by the existing fixatives, or to the presence of a type of organisation very hard to analyse in thin sections or to an actual lack of orga- nisation within the region of size that can be observed with this technique. Our opinion is that a combina- tion of the first two reasons given above is perhaps the most likely explanation. In this connection we feel it is pertinent to point out the possible use of high magnification stereo-photographs of fairly thin sections (from which removal of embedding material is not necessary) in elucidating the complex fine structure of chromatin. References 1. Caspersson, T., Chromosoma 1, 605 (1940). 2. Gibbons, I. R. and Bradfield, J. R. G., Biochhu. et Bio- pliys. Acta (1957, in press). 3. — /. Biophys. Biochem. Cytol. (1957, in press). 4. Palade, G. E., J. E.xptl. Med. 95, 285 (1952). 5. Porter, K. R. and Kallmann, F., Exptl. Cell Research 4. 127 (1953). Ultra-thin Sections of Avian Tubercle Bacilli in a New Embedding Medium A.M.Glaueri' and E.M.Brihger Slrangcways Rcscarcli Lahuiatoiy (iiul Papworlli llospilul. Camhriclgc The reproduction of the tubercle bacillus presents a particularly interesting subject for study. The mycobacteria may be considered to occupy an intermediate position between the ordinary bacteria, which reproduce by binary tission, and the Nocardia and fungus-like organisms that undergo a more complicated life-cycle involving budding, branching and mycelial development. We have previously studied the development of the avian tubercle bacillus in the phase contrast microscope (2) and were able to show that it can reproduce in more than one way. In some strains the rods of the original inoculum elongate and then divide directly by binary fission; these organisms behave like the ordinary bacteria and such strains have been described as "bacillary" strains. In other strains the original rods grow and branch, without immediate division, to form complex mycelial struc- tures. These mycelia finally break down by a process of simultaneous multiple division to produce a mass of rods similar in appearance to those of the original inoculum. These two types of development of avian tubercle bacilli have also been investigated in preparations of intact organisms in the electron microscope (I). Only a limited amount of information can be obtained from such a study owing to the thickness of the bacilli, but it was obvious that a marked difference in internal structure underlay the differen- ces in the reproductive processes. At the same time an unexpected development of round bodies or "intracellular units'' was observed within the elon- gated rods of the bacillary strains. These bodies have since been examined more closely by the technique of ultra-thin sectioning and the accompanying cyto- plasmic changes have been observed. As other workers with bacteria have also observed, we found that the organisms were frequently dis- torted during the familiar preparative procedures for ultra-thin sectioning. These observations led us to consider the possi- bility of using an alternative embedding medium. Maaloe and Birch-Andersen (5) have already had considerable success with a resin of the epoxy type and we have been experimenting with resins of the same series.- The ones we have been investigating are marketed under the trade name of Araldite. 1 Sir Halley Stewart Research Fellow. - These resins were developed by Messrs. Ciba Ltd. ol Basel and are made in England by Aero Research Ltd. of Duxford, Cambridge. A Standard liquid epoxy resin is used and is made more plastic by the addition of dibutyl phthalate. On the addition of a suitable hardener the resin sets uniformly, without shrinkage, to form a clear, light-gold block. Originally we used an aliphatic polyamine as the hardener, this being the usual type of cold-setting hardener for these resins. Unfortu- nately, as was discovered by Maaloe and Birch- Andersen (5), a mixture of the resin with this hard- ener is difficult to handle and is not ideal for electron microscopy. The mixture is very viscous so that im- pregnation is difficult and also it is not readily soluble in absolute alcohol. On the advice of Dr. Glauert, of Aero Research Ltd., we have experimented with a different hardener with promising results. If the casting resin is mixed with equal quantities of this new hardener, which is a liquid anhydride, the resultant mixture is sufficiently fluid to be handled easily and is readily soluble in absolute alcohol. The hardening process takes a considerable time at normal incubation temperatures, but it can be speeded up as much as required by the addition of an amine accelerator. After various trials we have found the following mixture to be suitable as an embedding medium: — ^^ Araldite'' for iiltra-thiii sections Casting resin M 10.0 ml Hardener 964 B 10.0 ml Dibiit\ I phthalate 1.0 ml Accelerator 964 C 0.4 ml Slight variations of this formula ma\ be found con- venient for difTcrcnt types of specimen. For ease of handling the resin is mixed and the specimens are soaked at 48 C. The fixation o\' the specimens in buffered osmic acid and dehydration in graded alcohols is the same as for methacrylatc embedding. From absolute alcohol the specimens are passed to a 50 50 mixture of alcohol and Aral- dite at 48 C for 1-2 hours, then to two changes of the Araldite mixture at 48 C for 2-3 hours and finally into gelatin capsules with fresh Araldite. The blocks harden in about 30 hours at 48 C. It has been found advisable to incubate the specimens at 48°C, because at other temperatures there is a tendency for soft specimens to rise in the cai-»siiic during the setting process. The resultant blocks have a similar hardness to methacrylatc and thin sections have been cut with ease. Parallel specimens were embedded in metha- crylatc so that a direct comparison could be made. 112 A. M. GLAUERT AND E. M. BRIEGER Fig. 1. Ultra-tliin section of avian tubercle bacilli embedded in methacryiate. The organisms are distorted. Note the complex nuclear apparatus and large cytoplasmic granules. 110,000. If the original inoculum is viewed directly, without sectioning, it is seen to consist mainly of short rods with electron-dense polar bodies and a transparent, structureless cytoplasm. After 24 hours' growth these rods elongate and round bodies are clearly visible within them. These bodies have distinct membranes and it was suggested that they might correspond to the segmentation spores of the Nocardia. Methacryiate. — Sections of the small, transparent rods of the inoculum show that they have large central light areas containing threads and granules, the "nuclear apparatus". The cytoplasm, which occupies a narrow peripheral zone, has a granular structure, the granules ranging in size from 100 to 200 A. There is some evidence of the presence of fine threads and membranes within the cytoplasm but the cells are not sufficiently well preserved for these to be accepted with any certainty. The cells are obviously swollen and distorted and nothing definite can be deduced concerning the nature of the nuclear material. After 24 hours" incubation the rods of the inocu- lum have elongated, the dense threads and granules in the nuclear region have more complex configura- tions and the cytoplasm is denser (fig. I). The cyto- plasm still has a granular structure and in some organisms there is also a scattering of larger granules of 200 to 400 A diameter. A few of the organisms are in process of dividing by binary fission to form two daughter cells, each with its own nuclear appa- ratus. At later stages in the development of the bacilli a very different pattern of internal structure is seen. Rows of round bodies are observed forming inside the bacilli. These units have a finely granular struc- ture of uniform density and are enclosed within a definite limiting membrane. Their formation is accompanied by an increase in the number and size of the larger cytoplasmic granules. The bodies do not appear to contain an organised nucleus and in the early stages of their development the nuclear appara- tus of the bacillus is still visible outside them. We inter- preted these bodies as spores (3), although the later stages of their reproduction will have to be followed before their nature can be clearly established. In structure and development they bear a remarkable similarity to the spores of the ordinary bacteria described by Chapman (4). Aralciite. — The study of similar organisms embed- ded in Araldite is only in its early stages but certain differences of structure have already been observed. As was stated earlier, most of the bacilli appear to be far better preserved. The cell wall is no longer separated from the cytoplasm and there is clear evidence of a cytoplasmic membrane underlying the cell wall (fig. 2). This membrane has proved to be particularly elusive in studies of methacryiate sec- tions. The fine limiting membranes of the developing spores are also clearly seen and appear to be double (fig. 3). There seems to be no doubt that these fine membranes are seriously distorted during methacry- iate embedding. The Use of Gelatin for Eniheddini: Bioloi^ical Objects 13 Fig. 2. Ultra-thin section of avian tubercle bacillus embedded in Araldite. The organism appears smooth and there is a fine cytoplasmic membrane underlying the cell wall. 60,000. Fig. 3. Ultra-thin section of avian tubercle bacillus embedded in Araldite. A spore is developing in the centre of the bacillus and is enclosed in a fine double membrane. 80,000. The so-called vacuole is usually filled with a fine network and the central dense structure has a far more luiiform appearance. Instead of the complex mass of threads and granules that are observed with methacrylate we find a smooth thread-like structure with associated dense granules. These results with Araldite are only preliminary but seem to us to be promising. Some similar tests have been made with mammalian tissues and there are indications that Araldite will be useful in the preparation of hard tissues, such as adult hairs. We would like to thank Dr. R. II. Cilaucrt. of Aero Research Ltd., for his cooperation throughout the course of this work. Some of the electron micrographs were taken in the Cavendish Laboratory, Cambridge, and we would like to thank Dr. V. E. Cosslett and Mr. R. W. Horne for providing electron microscope facilities. References 1. Brifger, E. M., Cossiftt, V. E., and Glaltrt, A. M., J. Gen. Microbiol. 10, 294 (1954). 2. Brifger, E. M. and Glauert, A. M., /. Gen. Microbiol. 7, 287 (1952). 3. — Naliire, 178, 544 (1956). 4. Chapman, G. B., y. Bacteriol. 71, 348 (1956). 5. Maaloe, O. and BiRf h-Andi rsfn. A., Vlth Symp. Soc. Gen. Microbiol. "Bacterial Anatomy", p. 261. (1956). The Use of Gelatin for Embedding Biological Objects in Preparation of Ultrathin Sections for Electron Microscopy V. P. GiLEV Lab. of Electron Microscopy, Acad, of Sciences of t lie USSR, Moscow 1 HE majority of investigators working in the field of electron microscopic cytology and histology use the method of embedding biological objects in methacrylates (3). It was proposed to embed biological objects in polyethylenglycols of high molecular weight which are soluble in water, (1,2, 5). But due to the fact that preparation of ultrathin sections of the objects em- bedded in these substances was difficult, this method did not become wide-spread in electron microscopy. The method we oflFer is based on the use of gelatin as embedding medium. It makes it possible to com- pletely exclude treatment of objects with organic solvents and to obtain sections up to 0.03-0.04 // thick and, perhaps, thinner. A 10 "o water solution of food gelatin is boiled for several minutes together with beaten-up hen egg al- bumen and activated charcoal. Per 300 cm-' of gelatin solution we take the albumen of one hen egg and 3 g of activated charcoal. Then the solution, while it is warm, is filtered first through paper and then through an asbestos bacterial filter. One portion of solution is evaporated in a thermostat at a 8 — 568204 Electron Microscopy temperature of 45 C until there remains half of its content, and the other one until there remain three thirds of the initial volume; in this way we obtain 20 "„ and 40 "„ solutions which arc used for impreg- nation and embedding. We may prepare 20 ",, and 40 °o solutions of refined gelatin in Ringer solution. The solutions should be absolutely transparent. To prevent from rotting some thymol is added. The objects (striated muscle tissue of axolotl, Atnblystoina punctatum) were fixed by osmium tetr- oxide (4) at pH 7.4-7.5 during 20 hours at a temperature of TC. After being washed in pipe- line water or in Ringer solution (1-4 hours), the objects were placed for 4 hours into 20 "o solution of gelatin heated up to the temperature of 37°C and then for 15 hours into a 40 "„ solution. During this period of time the pieces of muscle tissue to the size of 1 0.3 0.3 mm are well impregnated with gelatin. Then the 40 "o solution of gelatin with the objects enclosed in it is poured out on oil cloth and dried slowly at the temperature of 37 C to such a state in which gelatin is not brittle. 114 V. p. GILEV The plate of gelatin with the objects included in it is separated from the oil-cloth and cut for rectangu- lar blocks. The blocks are glued up with 40 "o solu- tion of gelatin to the old methacrylic blocks sharp- ened in the form of a truncated pyramid and placed for several hours into a thermostat (37'C) for com- plete drying. Immediately before cutting in a microtome the blocks are sharpened in such a way that the square of the section will not exceed 0.2 mm-. The blocks are kept in cans with tight caps. Cutting is effected with a glass knife (without fluid). In our work we used a microtome of Danon and Kcllenberger. The long side of the block should be parallel to the sharp edge of the knife. The blocks just dried are cut worse when the weather is dry; in this case it is better to cut them not earlier than in 24 hours after they were exposed to the air. In the case of considerable humidity of the air and blocks, it is recommended to dry them some time before cutting. Position of the knife in cutting gelatin blocks is usually, to some extent, steeper than in cutting methacrylic blocks. The rate of cutting is approximately I section per I sec. It is not difficult to obtain sections 0.03-0.04 /< thick. Usually the sections are formed in the shape of endurable un- disintegrating ribbons. These ribbons are sorted out and individual sections or groups of sections are trans- ferred with the aid of a thin filament into drops of water (or better of 2 % solution of acetic acid) lying on a I.e. Parlodion film that floats on the surface of water (temperature of about 37-40 C) filling a Koch cup. But better results are obtained when the sec- tions are placed into water of room temperature, which is subsequently heated up to 37-40 C. Expanding, the sections in most cases lose their bonds with each other and, therefore, not always a series of sections may be obtained. Then the film under each drop is punctured with a thin needle and the sections sink to the undamaged part of the film. The copper grids are placed on the film in such a way that the centre of the grid is above the section. After that from above a microscope slide is placed. Having put it upside down, we withdraw the film with grids.* After drying the specimens are ready for examination (fig. I ). For more complete removal of gelatin from the sections the ready grids with the specimens are placed for 2-4 hours into warm water (37-40 C) or into a weak solution of acetic acid. The osmium tetroxide that remains in the object after fixation and washing (especially when it is done for a short period of time) interacts with gelatin, after which the latter becomes less transparent, hardly removable from the section and creates a rather strong background that makes some fine de- a ** T^ , ' -.»'■ Fig. 1. Striated muscle tissue of the axo\otl( A mblystoma pitnctotttm). The section has been treated with 4% acetic acid. tails of the structure of the tissues less visible. There- fore, it is recommended that before enclosing the objects in gelatin, fixation should be shorter and washing longer. It can be supposed, however, that the presence of the background obliterating the bound- aries of some structures, is connected with the presence of substances which are otherwise elimi- nated or precipitated, while the specimen is treated with alcohols and methacrylates. In the case of thinner sections it is recom- mended to examine them without removal of em- bedding medium (gelatin). In this case the sections should be expanded in cold water (about - I to ^ rc). The tissues, embedded in gelatin, can be easily cut with a glass knife for sections 1 fi thick for exa- mination in the light microscope. In this case the blocks should not be too dry and, therefore, are kept in open vessels. The sections are glued up to micro- scope slides with albumen, to which some glycerine has been added. The gelatin is dissolved in warm water. References 1. Brandes, C. H., Mikrokosmos 44, N7, 167 (1955). 2. FiRMiNGER, H. I., Stain Techno/. 25, N 3, 121 (1950). 3. Newman, S. B., Borysko, E., and Swerdlow, M., /. Research Nat. Bur. Standards 43, 183 (1949). 4. Palade, G. E., J. E.xptl. Med. 95, 285 (1952). 5. Richards, A. G., Anderson, T. F., and Hance, R. T., Proc. Soc. E.xptl. Biol. Med. 51, N 1, 148 (1942). ^ This method ofmounting sections was elaborated together with V. I. Birjuzova, one of the workers of our laboratory. On the Preparation of Ultrathin Serial Sections by Means of a Watchmaker's Lathe W. NiKLOWITZ liistitiit fiir Mikrohiolof^ic iiiul L.xpcrinu'ntelle Theiapie, Jena, clcr Akademie cicr Wissenschaften zii Berlin Ultrathin sections suitablcfor studying biological objects in the electron microscope arc prepared by means of conventional microtomes or by making use of new constructions of these instruments (for references, see 16, 20). To-day's trend is to employ ultramicrotomcs which have proved most satisfactory— such as the excellent ultramicrotome of Sjostrand. However, since about one year we make use of a watchmaker's lathe in preparing ultrathin sections. This apparatus is characterized by great simplicity both in its con- struction and in its operation. I should like to try to give a short description of the instrument, and to report subsequently some results obtained. The basic principle of this ultramicrotome is a commercial watchmaker's lathe, as it was used al- ready by Giuntini and Edlinger (10). Technical de- tails have already been reported elsewhere ( 16). This ultramicrotome is fitted with a thermal advance of the knife similar to that recently described (6). The diflference is, that with our apparatus the cooling of the metal rod supporting the knife is utilized in forwarding the latter. According to the rotating principle, the object to be cut passes the glass knife (made of Jenaer Gerate-Glas 20) only once during one cutting cycle. This ultramicrotome provides se- ries of ultrathin sections that are relatively uniform and have a mean thickness of about 300 A. The thickness of the sections may be adjusted by means of the speed with which the sections are made. In the meantime several of these microtomes are put into operation, and we may now state that they have given the same satisfactory results. In order to demonstrate the usefulness and effi- ciency of this microtome, some results of our in- vestigations, partly still in course, partly already published, shall now be reported. The first micrographs of ultrathin sections shown were given for comparison only. They represent sections of the kidney of the white mouse, an organ generally chosen as an object for tests, because of the variety of its submicroscopic cellular structure (16). Regarding the problem of the origin of specific granules from the milochondria in Elvlich's ascites carcinoma of the white mouse, the microscopical (phase contrast) and histochemical investigations carried out in our institute by Kieser (12) shall be extended by means of ultrathin sections. The mito- chondria of the tumor cells have the same specific substructure as already described for other tissues (21). The cristae, however, may be arranged both in the longitudinal and the transverse direction of the milochondria. Furthermore, there are to be seen single or several spherical granules, strongly osmio- philic, and enveloped by a common membrane. They are, in early stages of development, of the same magnitude as the mitochondria. These preliminary results, therefore, may suggest that the granules possibly may arise from mitochondria, as is the case in the cloudy swelling of the kidneys (8). Recently it was shown on difTercnt objects that the plastids of the higher plants are formed of sub- microscopic lamellae (summarizing literature see Frey-Wyssling, (7)). Systems of such lamellae are demonstrable also in the chromatophores of the green algae. This fact has been demonstrated by means of a micrograph of a chromatophore of a green algae, the mean thickness of the lamellae being 30 to 40 A. This observation led us to the investigation of the substructure of rv«//(v^/nrfY/(' (blue-green algae) dur- ing the past few years. In this group of organisms, too, we were able to state that the chromatoplasm — the region of the cell containing the assimilative pigments — consists of submicroscopic systems of lamellae (18, 19). Having already furnished proof in a previous paper that systems of lamellae are to be found in Rhodospirillum rulvum, an autotrophic bacterium (17), we are now able to state definitely that /// all ori^anisms containitii; chlorophyll , theassi- milatory pif^ntents are probably attached to submicro- scopic systems of lamellae. Furthermore, three types of granules may be differentiated in cyanophyceae: small, strongly os- miophilic granules, granules of inorganic phosphate, and, as a particular and characteristic group, gran- ules exhibiting lamellar structure in ultrathin sections and having mitochondrial function, as was demon- strated in histochemical investigations. This latter group of granules was provisionally designed as "ferment active granules" (4, 5). Among the representatives of the Nostocaccae there are further distinct elements in the region of the ccntroplasm. a detailed description of which will be published elsewhere (19). For a number of years, we have also been con- cerned, to a certain extent, with the substructure of bacteria (13-15). The results of our recent investiga- tions, comprising primarily the problem of the nu- cleus and of equivalents of the nucleus respectively, will be published elsewhere. According to our obser- vations, the equivalents of the nucleus, both in bac- teria and in cyanophyceae. as seen in electron micro- 16 W. NIKLOWITZ Fig. 1. Electron micrograph of an ultra-thin longitudinal section from Escherichia coli (three hours culture). Magnifi- cation 90,000. scopic investigations, reveal a structure deviating from that of higher organisms. In our opinion the idea drawn from what was seen in uUrathin sections and light-microscopical investigations, i.e. that bac- teria contain true nuclei with chromosomes, is pre- mature, especially when taking into consideration that even the results concerning the fine structure of chromosomes in higher organisms are still rather incomplete. Moreover, comprehensive studies of fixed series of different stages of the development revealed that the image will largely depend upon the fixation. According to Geitler (9), emphasis should not rest on the alternative question nucleus or no nucleus, chromosomes or no chromosomes, but on exactly hitting upon the equivalents of the nucleus. From our investigations the following procedure has proved most favourable for the fixation. The objects — whether prefixed (2, 11) or not — are fixed in a puffered solution of OsO^ (pH 6.8; 7.1; 7.4), added with 0.2 Af saccharose for 10-15 min. at 4'C. This fixation is followed by a further one in formol (1:10) for 4-6 hours. This procedure avoids an unfavourably long expo- sure to OsOj, as well as the addition of NaCl (3). As has earlier been stated ( 1 ), a prolonged fixation with OsOj causes a destruction of the tissues, and the addition or a washing with NaCI entails an enormous loss of substances (22). Fig. I represents a section through Escherichia coli. The substructure of the cytoplasm is granular. In the central bright region filamentous elements with a mean thickness of 80 A may be recognized. From our investigations it became evident that the distribution and the diameter of these filaments will vary with different fixations. This short report at this Conference was intended to demonstrate that our ultramicrotome renders possible to do routine sections which are suitable for carrying out submicroscopic studies, and 1 should like to conclude my arguments citing a sentence of the nestor in the field of investigation of submicro- scopic structures, Frey-Wyssling, who states that just as classical physiology reached its present summit only following the perfection of histology, the pro- gress in physiology of the cell will depend upon shedding more light on the submicroscopic morpho- logy of the cell. References 1. Bahr, G. F., Exptl. Cell Research 9, 277 (1955). 2. Birch-Andersen, A., Maaloe, O., and Sjostrand, F.S., Biochim. et Biophys. Acta 12, 395 (1953). 3. Chapman, C. B. and Hillier, J., /. Bacterial. 66, 362 (1953). 4. Drews, G. and Niklowitz, W., Arch. Mikrobiol. 24, 147 (1956). 5. — ibid. 25, 333 (1956). 6. Ekholm, R. andZELANDER,T., EATJe/vV/fZ/rt 12, 195(1956). 7. Frey-Wyssling, A., Protoplasntatologia 2, A/2 (1955). 8. Gansler, Ft., Vortrag auf der 6. Tagung der Deutschen Gesellschaft fiir Elektronenmikroskopie, Miinster 1955. 9. Geitler, L., Fortschr. Bat. 17, 1 (1955). 10. GiUNTiNi, J. and Edlinger, E., Ann. Inst. Pasteui 86,671 (1954). 1 1. Kellenberger, E. and Ryter, A., Schweiz.Z. Pathol, u. Bakteriol. 18, 1122 (1955). 12. KiESER, H., Arch.Geschwulstforsch. (1957, in press). 13. Knoll, H. Zeifl-Nachrichten 5, 38 (1944). 14. Knoll, H. andZAPF, K.,Zentr. Bakteriol. Parasitenk., Abt. I Orig. 157, 389 (1951). 15. — ibid. 161, 241 (1954). 16. Niklowitz, W., Mikroskopie, Wien, 10, 401 (1955). 17. Niklowitz, W. and Drews, G., Arch. Mikrobiol. 23, 123 (1955). 18. — ibid. 24, 134 (1956). 19. — ibid. (1957. in press). 20. SiTTE, H., Mikroskopie, Wien, 10, 365 (1955). 21. Sjostrand, F. S. and Rhodin, J., E.xpil. Cell Research 4, 426 (1953). 22. Sylven, B., Acta Union Intern, contre le Cancer 7, 708 (1951). How to Prepare Ullralhin Sections of Tissue Cullures V. Dost A L Bi'hiins^-Werke, Marhiiii; a. d. La/in. and the Department of Hyj^'icne, Alhert-Liidwii^s-Univer.sitdt, Freihioi,' i. Br. Owing to improvements in method, tissue cultures have in recent years become of growing importance for the cuUure of viruses, for the quantitative deter- mination of infectiosity, for carrying out neutrah/a- tion tests, and for the morphological study of multi- plication processes. In addition, they are being used for diagnoses and for the production of vaccines. In recent years I have worked on the culture of viruses, especially the poliomyelitis virus and the vaccine virus. The basic materials used were monkey and calf kidneys which I prepared for the examina- tion in the electron microscope. The tissues treated (1,5) in culture bottles grow into a cell outgrowth predominantly in monolayers at the bottom of the container within a few days. Various methods as to how to produce ultrathin sections are already known. D. C. Stuart (4) specified a method in which the embedding, i.e. the poly- merization, takes place directly at the cell attached to the tube. C. G. Harford, A. Hamlin, and E. Parker (2) have the tissue grow on a formvar foil, after- wards embedding the latter. I chose to make a sedi- ment of tissue cultures which I obtained from full- grown, normal, and infected cultures. For preparing the sediment I used such tissues as are normally developed in producing poliomyelitis vaccine. The tissues were partly not infected, partly they displayed a certain state of virus multiplication within the cell. The tissue to be examined by electron microsocpy is processed up to its being embedded in the culture bottle, it is fixed with a solution of I "o phosphate-butTered osmium tetroxide (according to Sjostrand). In order to remove cell detritus, the cell surfaces were previously rinsed with Hanks" solu- tion. The cells were dehydrated with alcohol. The change to methacrylate mixture was via various Fig. 1. An ultrathin section of a monkey kidney tissue culture wiiich had been infected with vaccine-virus. The tissue was fixed 48 hrs. after infection. In the photograph the nuclei of two cells are to be seen which distinctly show the double membrane. Furthermore, the cell border is easily recognizable as a double membrane. In the protoplasma various mitochondria with their septa. All over the hyaloplasma there were lots of small, rotund forms; besides, there were some hyaline osmiophilic areas. Siemens Electron microscope UM 100 c, Magnification -28,000. 118 A. MAAS alcohol-methacrylate mixtures. Since the cell out- growth is predominantly in monolayers, the respective periods during which the tissue has to stay in the various media from fixation to embedding may be comparatively short. Cells were damaged by staying too long in alcohol of a higher percentage, e.g. over night. No shrinkage of cells was noticed by light microscopic examination. The tissue was detached from the bottle in the non-polymerized methacrylate mixture, by means of a rubber-coated, bent glass rod. By centrifuging the cell suspension at about 300-500 rpm for five minutes one gets a compact sediment. When properly fixed, its color is a dirty brown. Sedimentation was already effected in a butyl- methyl-methacrylate mixture (4:1) with 2 % dichlor- benzoylperoxide (3). The methacrylate mixture was not polymerized preliminarily; however, the filled gelatine capsules were evacuated for five minutes before being deposited in the incubator in order to ensure removal of gas pockets, which are easily formed in sediments. Incubation was carried out at 48X for about 30 hrs. The ultrathin sections were prepared with an ultra-microtome (Fernandez-Moran) placed at my disposal by courtesy of Messrs. E. Leitz at Wetzlar. The knife used is a diamond built into a container to receive the sections. The container was filled with an alcoholic solution of 25 %. The sections appeared in the shape of an uninterrupted band and spread out properly on the water surface within 15 minutes. By heating the water it was possible to speed up this process without the quality of the sections deterio- rating. The sections themselves showed grey-white interference colors. The bands of sections were re- ceived by mesh copper grids with a formvar film. The sections (fig. 1) were observed and photo- graphs were taken in a Siemens electron microscope Cm 100 c with stigmator and an aperture of 30 n and an accelerating voltage of 60 kV. The examinations carried out have proved that it is possible to obtain results which can easily be reproduced by a simple method of preparation, such as the preparation of sediments by trimming of the cells from the culture containers. It enables both infected and non-infected tissue cultures to be ex- amined by electron microscopy. These investigations were kindly supported by Drs. Grehn and Walter, Wetzlar. I also wish to extend my thanks to Miss M. Hahn of the Behring-Werke for her cooperation in preparing the sections and taking the electron micrographs. References 1. DuLBECco, R. and Vogt, M., /. Expil. Med. 99, 167 (1954). 2. Harford, C. G., Hamlin, A., and Parker, E., /. E.xptl. Med. 101, 6, 577 (1955). 3. Newmann, S. B., Borysko, E., and Swerdlow, M., /. Research Nat. Bur. Standards 4, 43, 183 (1949). 4. Stuart, D. C, Ann. Report 26 (1954). 5. YouNGNER, J. S., Proc. Soc. E.xptl. Biol. Med. 85, 202 (1954). Eine einfache Vorrichtung ZLim Anspitzen von plexiglaseingebetteten Objekten A. Maas ZentraUaboratorimu fiir angewandte Ubermikroskopie dcr Universitat Bonn L)as vor dem Schneidcn auf dem Mikrotom not- wendige Anspitzen plexiglaseingebetteter Objekte, das unter mikroskopischer Beobachtung von Hand mit einer Rasierklinge vorgenommen wird, ist bei kleiner ObjektgroBe sowie bei groBer Hiirte des Plexiglases mit Schwierigkeiten verbunden. Im fol- genden soil iiber eine Vorrichtung berichtet werden, die es gestattet, plexiglaseingebettete Objekte bis zu einer Dimension von einigen // in die Spitze einer Pyramide zu legen, deren Spitzen- und Fliichenwinkel exakt definiert sind. Das Objekt wird in iiblicher Weise in das halb- kugelformige Ende eines zylindrischen Plexiglas- blockes eingeschlossen. Der Plexiglasblock wird so- dann in eine Haltevorrichtung (Blockhalter) einge- spannt. Die sich beim Anspitzen des Plexiglasblockes ergebende Form des angespitzten Objektes ist mit- bestimmend fiir die GroBe und Giite der spateren Ultra-Diinnschnitte. Durch die GroBe des Spitzen- winkels wird die statische Festigkeit des Objektes beim Schneidevorgang festgelegt. Auf Grund der im Objekt beim Schneiden auftretenden Zug- und Druckspannungen wird somit die Giite des erhalte- nen Ultra-Schnittes beeinfiuBt. Mit Hilfe einer Rasierklinge wird der Plexiglas- block so angespitzt, daB sich das Objekt in der Spitze einer Pyramide befindet. Das Prinzip der Anordnung ist in Abb. 1 im schematischen Grundriss dargestellt. Der Plexiglasblock ist um eine Achse An um definierte Winkelbetriige drehbar und in der Liingsrichtung der Achse verschiebbar angeordnet. Das eingebettete Objekt kann mittels eines spater Anspitzen von plexiglaseingehetteten Ohjekten 119 Vitxijlai-BUick ANSICHT Spiegel ANSICHT VON BfW S€lTe Abb. 1. Prinzip-Skizze. J V,— Abb. 2. Oplik. noch zu besprechenden vereinfachten Kreuztisches in die Drehachse A„ verlagert werden (Justierung J). Das zum Anspitzen des Blockes dienende Messer befindet sich zentral verschiebbar auf einem Schwenk- arm (Verschiebungsrichtung V^), der in horizon- taler Ebene um den in Verliingerung von A„ liegen- den Punkt Z gedreht werden kann (Winkeleinstel- lung ^^^^/). Der so veranderbare und jeweils fest einstellbare Winkel zwischen K.v und der Richtung der Drehachse A„ ergibt den als Winkel zwischen zwei gegeniiberUegenden Fliichen der angespitzten Pyramide definierten Spitzenwinkel 2 rp. Der Winkel 7 ist stufenlos von 0-90 , der Spitzenwinkel der angespitzten Pyramide somit von 0-180 wiihlbar. Der Vorschub (Fg) des eingebetteten Objektes the acridine dyes were studied by means of electron microscopy and polarization optical analysis. Fig. 1 shows chondroitin sulphuric acid in a control sample and hg. 2 when treated with trypa- flavin. Except for myosin, all our components are globular. As demonstrated in fig. 2, the structure changes 132 F, GUBA, G. HAJOSSI-KEREK AND G. ROMHANYI Fig. I. Chondroitin sulphuric acid. Control sample. Fig. 2. Chondroitin sulphuric acid-trypaflavin complex. The reticular structure characteristic of trypaflavin complexes can be seen very well. when mixed with the dye. The dyes always brought about precipitation. The consistency of the precipi- tates was different with every compound; the most compact precipitate was obtained with rivanol. The results show that the change in structure is, in principle, characteristic for the dye, but in addi- tion the chemical composition of the substrate is of importance. These conclusions were supported by our polarized light analysis. We think that the structure which develops is due to a coupling of the macromolecules through the dye molecules. This is supported by the following observation: we solved the newly developed structure by the known ditTusion method with NaOH and ethyl alcohol respectively. On the elimination of either of the components the newly developed structure breaks up. The coupling depends on the steric behaviour both of the polyelectrolyte and the dye molecule. It is obvious that the development of this structure depends on the side groups of the acridine, chiefly of its NH., groups. References 1. DoGSON, K. S., Rose, F. A., and Spencer, B., Biochein. J. 60, 346 (1955). 2. RoMHANYi, G., Congress of the Hungarian Pathological Soc, Debrecen, 1955. VI CELL ULTRASTRUCTURE, GENERAL Elektronenmikroskopische Studien an Leberschnitten von Thyroxin-behandelten Ratten H. ScHULZi, H. Low, L. Ernster und F. S. Sjostrand Aus dem Anatoniischen Inst it lit des Karolinska Institutes und dem Wennei-Giens Institiit der Universitdt Stockholm Die Schilddriisenhormone bewirken eine Labilisie- rung der zelluliiren Multienzymsysteme, wie bioche- mische Ergebnisse von Aebi und Abelin (1 ), Tapley, Cooper und Lehninger ( 1 3) und von Klemperer (6, 7) gezeigt haben. Martius und Hess (8, 9) fanden bei steigenden Thyroxinkonzentrationen eine fortschrei- tende Hemmung der oxydativen Phosphorylierung in der Atmungskette, die bis zu einer vollstiin- digen Entkopplung fiihrt. Eigene Studien an iso- lierten Mitochondrien von thyreotoxischen Ratten- lebern ergaben, daB die Wirkung des Thyroxins wahrscheinlich eher verbunden ist niit strukturellen Veriinderungen der Multienzymsysteme als mit einer spezifischen Hemmung einzelner Enzyme (2, 3). Wir haben unsere elektronenmikroskopischen Untersuchungen durchgefiihrt, um Befunde der Morphologie biochemischen Ergebnissen gegeniiber zu stellen. Eine zusammenfassende Beschreibung der submi- kroskopischen Struktur der normalen Rattenleber wurde bereits von Fawcett (4) durchgefiihrt. Palade und Siekevitz (11) beriicksichtigten vorwiegend die Lebermikrosomen. Das Verhalten der Lebermito- chondrien unter pathologischen Bedingungen wie Hunger und akute Hypoxie untersuchten Gansler und Roullier (5), sowie Molbert und Guerritore (10). Erwachsene Ratten erhielten intraperitoneal eine tagliche Dosis von 0,4 mg DL-Thyroxin (Hoffmann- La Roche) uber 5 Tage; am sechsten Tag wurden die Tiere getotet und Leberstuckchen von 0,5-1 mm Kantenlange lebensfrisch nach Sjostrand (pH 7,2) fixiert. Postmortale Veriinderungen versuchten wir auszuschlieBen, indem wir zu jedem Versuch ein Normaltier unter denselben Bedingungen priiparier- ten, sowie nur Schnitte aus der Oberfliiche der Gewebsstuckchen verwandten. Die Schnitte fertigten wir an mit dem Ultramikrotom nach Sjostrand. Fiir die Aufnahmen benutzten wir das RCA EMU 2c Elektronenmikroskop. Die in den Tabellen und im Text angegebenen MaBe sind das statistische Ergeb- nis von Messungen an verschiedenen Leberzellen von den untersuchten sechs Ratten: iiber 100 Mes- sungen liegen den jeweiligen Zahlen zugrunde. Zum lichtmikroskopischen Nachweis des Glyko- gens mit dem Fiirbeverfahren nach Best wurden einige kleine lebensfrische Leberstuckchen von den Versuchs- und Kontrolltieren zur Vermeidung der „Glykogenflucht" funf Minuten mit einer m 3 NaOH-Losung behandeh (12), danach in absolutem Alkohol fixiert und in Paraffin eingebettet. In unseren elektronenmikroskopischen Studien untersuchten wir besonders die Veriinderungen an den Lebermitochondrien. Nach Behandlung mit Thyroxin zeigen die Mitochondrien eine deutliche Schwellung und eine Aufhellung der Matrix. Die Aufhellung der Matrix beginnt immer in der Mitte eines Mitochondriums und nimmt allmiihlich zur Peripherie zu. In Normaifallen besteht die Matrix aus einer iiber das ganze Mitochondrium gleich- maBig verteilten, feingranulierten Grundsubstanz von miiBiger Osmiophilie (Abb. 1). Bei einer Schwellung ist sie zusammengesetzt aus unregelmaBigen Flecken mit unterschiedlichem, weniger dichtem Kontrast Abb. I: Aiissclinitl aus einer normalen Leberzelle der Ratte. Zahlreiche liings- und quergeschnittene Mitochondrien. Im Cytoplasma auBerdema-Cytomembranen sowie doppeltkon- turierte Membranen, die die Mitochondrien zirkuliir umge- ben. Elektronenoptisch 8600 , Abb. 24000 . ^ Wissenschaftlicher Assistent am Pathologischen Institut der Medizinischen Akademie Diisseldorf; Stipendiat der Stadt Diisseldorf. Leberschnitte von Thyroxin-behandelten Ratten Tabelle 1 . Lc'inge iind Breite der Mitochondrien. 35 Geringste GroBte Breite, n Breite, n Durch- schnittl. Geringste GroBte Durch- schnittl. Breite, /' ^ ^ Lange, Verhaltnis Breite zu Lange Normale Lebermitochon- drien der Ratte 0,136 0,506 0,302 Nach Behandiung mit Thyroxin 0,528 0,566 0,939 0,578 0,801 1,73 2,187 1,03 1,376 3:10 6,6:10 Tabelle 2. Anzahl und Lange der Innenmemhranen in eineni M itochondrien-Ldngsschnitt . Hochste Anzahl der Innen- memhranen Kleinste Anzahl der Innen- memhranen Durchschn. Anzahl der Innen- memhranen GroBte Geringste Durchschn. Liinge einer Liinge einer Liinge der Innen- Innen- Innen- memhran membran memhranen m/< m/< mil Normale Lebermitochon- drien der Ratte . . . Nach Behandiung mit Thyroxin 34 25 19 10 380 189 48 16 128 86 Abb. 2: Ausschniti aus einer Leberzelle der Ratio nach Behandiung mit Thyroxin. Geschwollene Mitochondrien und Vakuolisierung des Cytoplasmas. Elektronenoptisch 8600 , Abb. 24000 . und darin liegenden feinen fiidigen Strukturen (Abb. 2). Es ist mogUch, daB dieses durch eine strukturelle Veriinderungder EiweiBmolekiile bedingt ist. Andere geschwollene Mitochondrien habcn eine unveriinderte Matrix. Die morphologischen Unter- schiedc diirften biochemisch verschiedcnen Labili- tatsstufen der Multienzymsysteme entsprechen. Das wesentlichste Kriterium fur eine Mitochon- drienschwellung im elektronenmikroskopischcn Bild ist eine Breitenzunahme des Mitochondrienkiirpers. Das GroBenverhaltnis von Breite zu Liinge bctriigt in Normalfallen 3:10, nach Thyroxinwirkung 6.6: 10 (Tabelle 1). Die statistische Auswertung der elcktronenopti- schen Befunde ergibt weiterhin, daB die Gesamt- oberfliiche der ,,cristae mitochondriales" nach Be- handiung mit Thyroxin sich gcgeniiber normalen Lebermitochondrien um maximal 30 ",, vermindcrn kann. Auf Schnittbildcrn ist die durchschnittliche Anzahl der Innenmemhranen pro Mitochondrium \cin IS aul' 10 reduziert: die durchschnittliche Lange einer Innenmembran ist um 'j verkiirzt (Tabelle 2). Oft erkennt man auf den Bildcrn nur noch 15 m/< kleine Restc von Innenmembrancn. Geschwollene Mitochondrien sind stets umgeben von intakten AuBcnmembranen. Durch die Volumcnzunahme ist die Gesamtohertliiche der MitochondrienauBenmem- branen um das 3^ fache vergroBert worden. Da die AuBcnmembranen nicht diinner geworden sind, muB eine Neubildimg von Mcmbranmaterial erfolgt sein. Es ist moglich,daBdiedafiJrnotv\endigen Baubestand- teile von den Innenmemhranen herrLihren. FaBt man die anahtischcn Messungen der Membransysteme zusammen (Tabelle 3), so sind nach Behandiung mit 136 H. SCHULZ, H. LOW, L. ERNSTER UND F. S. SJOSTRAND Tabelle 3. Dbersicht der Messimgen an den Mitochondrien-Innen- und Aufienmembranen. AuBenmembranen in A Innenmembranen in A „ ^, . Osmiophile Osmiophobes ^ ^, •. Osmiophile Osmiophobes Gesamtbieite c u- u* t * n Oesamtbreite c u- L^ r ^ ^^ Schichten Intervall Schichten Intervall Mittel Mittel a Mittel Mittel o Mittel a Mittel Nor male Lebermitochondrien der Ratte Tier I Tier II Tier III Wert: 168±3 16 42 ± 4 19 84 + 2 20 118±8 25 53 ±5 34 48 ±4 9 128±6 21 50r 12 8 38 r 5 7 147±7 32 38 + 6 18 42±4 16 147±2 12 46 r 8 15 55 ±3 13 189 + 4 19 63 ±3 21 63 + 7 27 150 A 45 A 60 A 150 A 50 A 50 A Nach Behandliing mit Thyroxin Tier I 174±8 9 44+3 12 78 ±4 10 1 83 r 8 18 57r3 6 69±4 8 Tier II 162±5 13 42+4 6 87±4 10 172 + 6 12 61±4 8 76±6 20 Tier III 170 + 3 4 48- 3 8 71±5 5 189±3 21 48^6 12 65 ±5 16 Wert: 170 A 45 A 80 A 180 A 55 A 70 A Thyroxin die osmiophoben Schichten der Aufien- und Innenmembranen um 20 A verbreitert, was wahrscheinlich auf eine Schwellung zuriickzufUhren ist. Die osmiophilen Schichten der Membransysteme bleiben unverandert. Thyroxin bewirkt auBerdem Veranderungen am Cytoplasma der Leberzellen. Man findet zahlreiche verschieden groBe, iiber die ganze Leberzelle gleich- maBig verteihe Vakuolen, deren Inhalt elektronen- optisch leer ist. Die Membran der Vakuolen ist 40- 65 A dick und von auBen mit homogenen Partikeln bedeckt. Der seitliche Partikelabstand betriigt 100- 210 A, die Partikelbreite 1 20 A. Wir nehmen an, daB die Vakuolen aus den a-Cytomembranen durch eine Starke Schwellung der homogenen Zwischenschichten entstanden sind. Diese Veranderung ist so ausgepragt, daB man von einer weitgehenden Veranderung des Ergastoplasmas sprechen kann (Abb. 2). Auf Grund vergleichender lichtmikroskopischer Untersuchungen ist in den Vakuolen wahrscheinlich kein Glykogen enthalten. Die festgestellten Veranderungen (Abb. 3) an den 1 i ^w. t 50 h 50ft I50fi / ^- 150 ft -► / (,0k -1 hSft-*' % -ISO f) Abb. 3. Schematische Darstellung der Modifikationen an den Mitochondrien und den a-Cytomembranen der Ratten- leber nach Behandlung mit Thyroxin. Links sind die normalen Verhaltnisse dargestellt. Geformte Sekrete der Mitochondrien von Paraiiicciiiiii 137 Mitochondrien und am Ergastoplasma bcruhen auf Schwellungsvorgiingen, die veriirsacht sind durch eine Jnsuffizienz der osmotischen Regulation. Die Schwellung der Mitochondrien, die ,.in vitro" auf Grund zahlreicher biochemischer Studicn nachge- wiesen wurde. ist auch aus unseren elektroncn- optischen Aui'naiimen ersichtlich. Ob die Insuitizienz der osmotischen Regulation z. B. bedingt ist durch einen ATP-Mangel oder durch lonenverschiebungen, kann aus den elektronenoptischen Ergebnisscn nicht beantwortct vverden. Die Fragen der Membranverminderung und Mem- branvermehrung sind moglicherweise verbunden niit Anderungen in der Atmungsintensitiit des Mitochon- driums. Aus bisherigen Untersuchungen zum Wir- kungsmcchanismus der Schilddriisenhormone ist be- kannt, daB bei der Hyperthyreose, trotz reichlichem O^-Angebot. eine verminderte Fahigkeit besteht, O^ aufzunehmen. Die eigentliche Ursache der Mito- chondrienschwellung besteht jedoch in einer Labili- sierung der enzymatischen Aktivitiit. wie eigene bio- chemische Untersuchungen bestiitigt haben. Die Unterschiede in der Morphologic der Mitochondrien entsprechen hierbei verschiedenen Labilitiitsstufen der Multienzymsysteme. Es bleibt die Frage zu erdrtern, ob mit den elektronenoptischen Bet'unden bewiesen werden kann, daB die Modifikationen am Chondriom und an den a-Cytomembranen dem ,,in vivo"-Zustand entsprechen. (Jber die abschlieBende Prufung der morphologischen Veriinderungen in Be- ziehung zu den biochemischen Ergebnissen wird ausfUhrlich an anderer Stelle berichtet. LiTERATUR 1. Alhi, H. und AnhUN, I., Elcklrolyt- und Fermcnthaus- halt dcr hypcrthyrcotischcn Leber. Biochem. Z. 324, 364-384 (1953). 2. Beykr, R. E., Low, H., und I.knsiik, L., Ihc ctVcci of thyroxine on mitochondrial stability. Proc. Norwegian Biochem. Soc, Oslo, 2-3 (1956). 3. — Acta Clu'iii. Scancl. (1957, in press). 4. Fawcett, W., Observations on the cytology and electron microscopy of hepatic cells. J. Nat. Cancer Inst. 15, 1475-1502 (1955). 5. Gansler, H. und Rouiller, Cm., Motlilicaiions ph>sio- logiques et pathologiques du chondriome. (Ltudc au microscope electronique.) Sc/iweiz. Z. allgem. Pathol. II. Bakteriol. 19, 217-243 (1956). 6. Klemperer, H. G., The uncoupling of oxidative phos- phorylation in rat-liver mitochondria by thyroxine, triiodothyronine and related substances. Biochem. J. 60, 122 128 (1955). 7. — The uptake of thyroxine and triiodothyronine by rat-liver mitochondria, ibid. 60, 128-135 (1955). 8. Martius, C. und Hess, B., The mode of action of thyroxin. Arch. Biochem. Biophys. 33, 486^87 (1951). 9. — LJber den Wirkungsmechanismus des Schilddriisen- hormons. Biochem. Z. 326, 191-203 (1955). 10. MoLBERT und GuERRiTORE, ziticrt nach BCrnNER, F., Hemmung der Oxydationen als pathogenctisches Prinzip. Klin. Wochschr. 34, 777-781 (1956). 11. Palade, G. E. und Siekevitz, P., Liver microsomes. An integrated morphological and biochemical study. /. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-201 (1956). 12. Takahashi, K. und Iwase, S., On artifacts appearing in the histochemical fixation of glykogen. /. Biophys. Biochem. Cytol. 1, 391-399 (1955). 13. Tapley, D. F., Cooper, C, und Lehninger, A. L., The action of thyroxin on mitochondria and oxidative phosphorylation. Biochim. Biophys. Acta 18, 597- 598 (1955). Die Entstehung, (die Vermehrung un(d die AbscheicJung geformter Sekrete der Mitochondrien von Paramecium K. E. WOHLFARTH-BOTTERMANN Zentral-Laboratoriiim fiir augewandte Vbennikroskopic der Univcr.sitcit Bonn Uber den Organellcharakter und die wichtigen Funktionen der Mitochondrien im Zellstoffwechsel besteht heute kein Zweifel mehr: Biochemische Untersuchungen haben die stoftliche Zusammenset- zung und die enzymatische Aktivitat dieser Zell- organellen aufgezeigt (5). Das Elektronenmikroskop konnte in den letzten Jahren erweisen. daB der hochgeordneten enzymatischen Funktion eine ebenso hohe strukturelle Ordnung zu Grunde liegt (6-10, 14, 15). Dagegen fehlen uns bis heute eindeutige Auf- schliisse iiber die Entstehung und die Vermehrung der Mitochondrien, was fiir die Beurtcilung eincr Kontinuitat des Chondrioms von Bedeutung ist. Es geht um die Frage, ob wir die Mitochondrien als Autoduplikanten zu betrachten haben oder ob sie etwa aus anderen cytoplasmatischen Strukturen entstehen konnen (1, 4). Bekanntlich wird versucht. gewisse Phanomene der plasmatischen Vererbung durch eine Autonomic des Chondrioms zu dcuten. Als Untersuchungsmaterial diente ein Klon von Para- incciuni caiidatiiiii. dcr in Hcudckokt kulli\icrt wurde. Nach Fixation mit Osmiumtctroxyd, Formalin odor mit dcm Gemisch nach Rcgaud, Champy und Maximow wurden die Zellen in einer ansleigcnden Alkoholrcihc enlwiissert und in Plcxiglas eingcbcttct. Diinnschnitte von 200 300 A Dickc geiangtcn ohnc Herausloscn des Einbcttungsmediums im Elektronenmikroskop zur Un- tersuchung. (Ultra-Mikrotom nach Sjostrand, Siemens- Ubcrmikroskop Typ 100 d, 80 kV.) Als bcstcs Fixicrungs- mittel erwics sich eine l"oige Losung von Osmiumtctroxyd bzw. cine 10"oige Formalinlosung, beidc mit dcm Acetat- veronalputTcr nach Michaclis auf cincn pU-\Vert zwischen 6,5 und 7,2 cingestellt. Als Kontrastmittel haben sich Phosphorwolframsaure (PWS P.,0,-24WO;, • xH.,0)undThalliumnitrat(Tl = TINO:,) bewiihrt, beidc jewcils zu i "„ in VO^o'gem Alkohol gelost (15). 138 K. E. WOHLFARTH-BOTTERMANN Fig. 1. Schematische Darstellung der Feinstruktur der Mito- chondrien von Paramecium caudattim. A, schematischer Dunnschnitt; B, raumliche Rekonstruktion. Es zeigte sich, daB die Mitochondrien von Para- nu'ciiim einen anderen Bauplan besitzen als die Mitochondrien aus Saugergeweben. Im Inneren der Mitochondrien finden sich als wesentliche Struktur- elemente Rdhren bzw. Kanale. Uber den Inhalt der TubuH mitochondriales lassen sich vorerst nur Vermutungen anstellen. Es erscheint moglich, daB sie eine Fliissigkeit enthalten, die im elektronenoptischen Bild bislang nicht zur Darstel- lung gebracht wurde. Zweifelsohne bewirken aber diese Rohrenstrukturen eine betriichtHche VergroBe- rung der reaktionsfahigen Oberflache innerhalb der Mitochondrien. Wir kommen fur den Aufbau der Mitochondrien von Paramecium zu einem Schema wie nach Fig. 1, das gleichzeitig die Unterschiede im Aufbau von Paramecium-Mitochondrien einerseits und dem bis- lang bekanntgewordenen Strukturprinzip von Sau- ger-Mitochondrien (6, 8, II) andererseits deutlich macht. Da man bei Paramecium unter otpimalen Kultur- bedingungen bis zu 4Zellteilungen pro Tag erzeugen kann, wurden nun Tiere mit hoher Teilungsrate iiberpriift in der Hoffnung, Aufschliisse iiber die Entstehung oder Vermehrung der Mitochondrien zu gewinnen. Es lieB sich eine ziemlich geschlossene Entwicklungsreihe von Mitochondrien nachweisen. Aus kleinen cytoplasmatischen Blaschen entstehen groBere Gebilde, die wir als ,,Promitochondrien" bezeichnen konnen. Diese Promitochondrien entwickeln Mikrotubuli, die durch weiteres Wachstum in normal groBe Tubuli mitochondriales ubergehen, wobei gleich- zeitig das Mitochondrium selbst heranwiichst. Diese Entwicklungsstadien finden sich nur im Endoplasma. Uber die Natur der cytoplasmatischen Blaschen kann noch keine sichere Aussage gemacht werden. Mit Sicherheit sind die cytoplasmatischen Blaschen nicht mit ,,Mikrosomen" oder „Biosomen" zu iden- tifizieren (nach Eichenberger (3) sollen die Mito- chondrien durch Umwandlung von Mikrosomen ent- stehen). Unsere heutigen Forschungsmittel erlauben noch nicht, die etwa 700 A groBen ,, cytoplasmatischen Blaschen", aus denen die Mitochondrien entstehen, naher zu charakterisieren. Die Frage nach der Konti- nuitat und Autonomic des Chondrioms kann noch nicht endgultig beantwortet werden. Die Untersuchung von Zellen mit hoher Teilungs- rate erbrachte auch weitere Befunde iiber den Ver- mehrungsmodus der Mitochondrien. In den licht- mikroskopischen Untersuchungen hatten Danneel und Giittes (2) sowie Steiner (13) bereits eine Tei- lungsfahigkeit der Mitochondrien verschiedener Zel- len wahrscheinlich gemacht. Wir finden bei Parame- cium Stadien, die sich sowohl als Querteilungen als auch eine Art Knospung interpretieren lassen. Von einer gleichmaBigen Verteilung der Substanz des Mitochondriums kann bei solchen Durchschnii- rungen keine Rede sein. Vielmehr lassen sich alle Zwischenformen zwischen Teilung und Abschniirung verfolgen. Von besonderem Interesse ist eine Erscheinung, die sich wiederum an Zellen mit hoher Teilungsrate besonders deutlich zeigt. Man kann an zahlreichen Mitochondrien verfolgen, daB sich die begrenzende Doppelmembran ofTnet und Tubuli ins Cytoplasma entlaBt. Dieser Befund diirfte von Bedeutung fur den Funktionsmechanismus der Mitochondrien sein, wenn sich zeigen lieBe, daB es sich hier wirklich urn eine Art sekretorischer Tiitigkeit der Mitochondrien handelt. Die Deutung muBte mit besonderer Vorsicht ge- schehen, da uns ja das Elektronenmikroskop immer nur einzelne Zustandsbilder, nicht aber den konti- nuierlichen Ablauf eines Vorganges in der Zelle zu beobachten gestattet. An Hand eines groBen Untersuchungsmaterials lieB sich erharten, daB man wirklich von einer Abscheidung geformter Sekrete bei den Mitochon- drien sprechen kann. Die Richtigkeit dieser AufTas- sung wird durch folgende Befunde bestiitigt: 1) Der Aquivalenzgrad der elektronenoptischen Bil- der zum lebenden Zustand kann aus der Erfah- rung zahlreicher Reihenversuche mit verschiede- nen Fixierern, pH-Werten und Kontrastierungen als gut bezeichnet werden. 2) im Cytoplasma lassen sich auch in der niiheren Umgebung von Mitochondrien Strukturen nach- weisen, die den Tubuli mitochondriales auBer- ordentlich iihnlich sind. 3) Eine Sekretion von Tubuli konnte nur selten an Zellen mit geringer Teilungsrate beobachtet wer- den, sie tritt gehiiuft bei Zellen mit hoher Teilungs- rate auf, bei denen der StofTwechsel erhoht ist. 4) Und letztlich liiBt sich an entleerten Mitochon- Changes in ihc Ciliary Epithelium 139 -Endoplosma VKl^ Ektoplasma - Fig. 2. Schematische Darstellung der Entstehung (A), der Vermelirung (B) und der Abscheidung (C) geformter Sekrete der Mitochondrien von Paramecium caiidati/m. drien eine Regeneration der Tubuli verfolgen, und zwar bilden sich in diesen entleerten Mitochon- drien zunachst wie in den Promitochondrien Mi- krotubuli, die wieder zu normalen Tubuli mito- chondriales heranwachsen. Wir haben hier also eine echte Regeneration ein- zelner Mitochondrien vor uns. Die Ergebnisse iiber Entstehung, Vermehrung und einen Funktionsmechanismus der Mitochondrien lassen sich schematisch wie in Fig. 2 zusammen- fassen. Ein Abdruck der Belegaufnahmen war im Rahmen dieses Tagungsberichtes nicht moglich. Ihre VerolTentlichung erfolgt an anderer Stelle. Die Untersuchungen wurden durch cine Sachbcihilfe der Deutschen F-orschungsgemcinschafl ermoglicht. Frl. Chr. Brodt dankc ich wiederum fur wcrtvolle technische Assistenz. LiTF.RATUR 1. Ai.TMANN, H. W. u. a.. Das Cytoplasma. In Handbuch der Allgemcinen Palhologie, II, 1. Berlin (Goltingcn)- Heidelberg, 1955. 2. Dannfel, R. und GGttes, E., Naturwissenschaften 38, 5, 117 (1951). 3. EiCHENBERGER, M., E.xptl. Cell Research 4, 275 (1953). 4. Frey-Wyssling, A., Protopiasmatologia II, A 2. Wien, 1955. 5. LiNonrRG, O. und Ernsti r, L., Protopiasmatologia III, A4. Wien, 1954. 6. Palade, G. E., /. Histocheni. Cytodiem. 1, 188 (1953). 7. Powers, E. L., Emret, C. F., und Roth, L. E., Biol. Bull. 108, 2, 182 (1955). 8. Rhodin, J., Correlation of Ultrastructural Organization and Function in Normal and Experimentally Changed Proximal Convoluted Tubule Cells of the Mouse Kidney. Karolinska Institutct, Stockholm, 1954. 9. Sedar, a. W. und Portir, K. R., /. Biophys. Biochem. Cylol. 1, 583 (1955). 10. Sjostrand, F. S., Nature 171, 30 (1953). 11. — International Union of Biological Sciences, Series B 21. Groningen, 1954. 12. Sjostrand, F. S. and Rhodin, J., Expil. Cell Research 4, 426 (1953). 13. Steiner, M., Naturwissenschaften 41, H. 8, 191 (1954). 14. Wohlfarth-Bottermann, K. E., Z. Naturforsch. (1957, im Druck). 15. — • Diese Proceedings, S. 124. Changes in the UUrastructure of the Ciliary Epithelium during Inhibition of the Secretion of Aqueous Humour A. Holmberg The Lahonitory for Biological Ultraslruclurc Research of tite Department of Aiuiloniy, Kaioliiisi\a Inslitiilet, Sloeklwlni It has been shown by many investigators (I, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11) that the epithelium of the ciliary body plays an important role in the formation of aqueous humour, partly as a barrier between blood and aqueous humour, and partly as an actively secret- ing epithelium. This investigation coinprises only the innermost, non-pigmented layer of the ciliary epithe- lium. Rabbits were used as experimental animals. The tissue has been fixed in vivo by injection of 1 "„ osmic acid in veronal-acetate buffer into the posterior chamber of the eye. The animals were kept under general anestesia (nembutal). After 15-20 minutes part of the ciliary body was removed and the fixation continued in \itri> for further Zl-A hours. The animals, treated with Diamox, were partly nephrectomized, partly not. The nephrccto- mized animals were given 10 mg Diamox per kg body weight intravenously, the others 100 mg Diamox per kg body weight. As control animals, besides the normal ones, animals were used which instead of Diamox were given Diazil in equal amounts. The fixation was carried out after different intervals after the injection. The normal stnietiire. — In this report brief men- tion will be made of some of the cell components which seem to undergo changes after inhibition of the secretion. Most characteristic for the non-pigmented epithe- lium of the ciliary body arc the ;'>-cytoniemhranes. (hg. 1). They stand out as iriplc-laycred membranes with two osmiophilic components, each about 40 A thick, and one central osmiophobic layer about 70 A thick. At the cell surface one can clearly see how the membranes are continuous with the cell membrane. Thus the /^-cytomcmbranes may be interpreted as folds of the cell membrane, but it seems probable 140 A. HOLMBERG ■*- //- Fig. 1. /?-cytomembranes in the non-pigmented epithelium of the cihary body. Magnification 70,000. that the central, osmiophobic layer, because of its regular thickness, is not a simple extracellular tissue space. The membranes are localized only to the apical parts of the cell, and do not extend deeper into the cell than to the apical part of the nucleus. Outside the cell membrane a basement membrane is observed 250-350 A thick, separated from the cell membrane by an interspace 400-700 A wide. The mitochondria are relatively small with a mean width of only 0. 1 8 //. Most of them are built up in the common way, with the inner double membranes oriented mainly perpendicularly to the outer double membrane. In some cases, however, the inner mem- branes extend parallel to the long axis of the mito- chondrion and along its whole length. In none of these cases have any connections between the inner and outer membranes been seen. The Golgi apparatus (fig. 2) is without exception encountered in the basal part of the cells. In each cell one can observe 1-3 Golgi units, each consisting of the well-known components: 2-3 rows of double membranes, 7-cytomembranes, a few larger vacuoles, and several small vesicles. Each single osmiophilic component of the double membranes is about 50 A thick. Both the vacuoles and the vesicles are bounded by a single membrane, about 50 A thick. Changes in the idtrastructure after injection of Diamox. — Diamox produces changes in the non- pigmented epithelium in at least three of its compo- nents: the cytoplasm, the mitochondria and the Golgi apparatus. The most marked changes in the cytoplasm is seen within 30 minutes after injection of Diamox. The cells are filled with small vesicles, in the deeper layers mostly very regularly spread, but close to the surface often congregated in large groups. It is striking how the vesicles in these groups are arranged in rows or concentric circles, resembling the arrangement of the /i-cytomembranes. After more than 30 minutes after injection of Diamox the amount of vesicles decreases and at intervals longer than 60 minutes they seem to be practically absent from the cytoplasm. Under the influence of Diamox there is a pro- nounced increase in the width of the /7//7()f//o//fl'r/a from the normal 0.18 /< to about 0.25 /<. This increase is due to a real increase of the volume of the ground substance of the mitochondria and not to such a swelling as is characteristic for the post-mortem changes. The alteration of the mitochondria appears very soon; it is seen already within 15 minutes after injection of Diamox and persists for a long time. Thus 2 hours after injection the width of the mito- chondria is still about 0.25 //. As far as can be seen Changes in l/.c Ciliary Ep it helium 141 Fig. 2. Golgi apparatus from a normal animal. One Golgi unit with several membranes, a tew large vacuoles and some small vesicles. Magnification 53,000. Table 1 . The vacuolization of the Golgi apparatus after Diamox. Number Experiment Number of Golgi Number of vacu- of regions oles per Golgi 'mals observed region per section per cell ani Normal animals; no 12 nephrectomy Control animals after 3 nephrectomy (Diazil) 30 min. after 10 mg 3 Diamox per kg body weight; nephrectomy 60 min. after 10 mg 3 Diamox per kg body weight; nephrectomy 120 min. after 10 mg 3 Diamox per kg body weight 30 min. after 100 mg 3 Diamox per kg body weight; no nephrectomy 31 78±10 7 79 + 1 1 4 86±18 7 93±12 13 193-12 11 173 ■ 11 4 228 z 40 6 184+13 4 142+ 7 5 155-15 6 79 • 10 6 116:* 15 9 118r 7 6 195r23 6 174+16 4 198 + 25 86 r 4 198±16 160±12 104 ■ i: 189: now, there are no other changes in the mitochondria, but the analysis is not yet finished. In the Golgi apparatus there is a great increase in the amount of the small vesicles (fig. 3). A quantita- tive analysis has been performed by counting all vesicles seen in the Golgi apparatus on one section through a cell. The result is presented in Table 1. This informs of the fact that the changes in the Golgi apparatus appear very soon and that the number of vesicles decreases in animals killed at longer intervals after the injection of Diamox. Thus, after two hours the amount of vesicles is about the same as in the control animals. Another change in the Golgi apparatus concerns the Golgi membranes, which normallv lie in 2-3 rows with 4-5 membrane pairs in each, sometimes split up into several units with onl\ 1 3 mem- brane pairs (fig. 3). Finally it must be pointed out that in the control animals no such variations have been observed in the cytoplasm, the mitochondria or in the Golgi appara- tus. Discussion. — Concerning the cell structure under normal conditions it should onl\ be emphasized that the organisation of the apical parts of the cells, with the ;J-cytomembranes and the basement mem- 142 A. HOLMBERG ^ ■V ■■'■ -*-■ t. 1^ ~m*K Fig. 3. Golgi apparatus from an animal fixed 15 minutes after injection of 10 mg Diamox per kg body weight. Several Golgi units (arrows) with numerous small vesicles. Magnification 50 000. brane outside the cell surface membrane, is also a characteristic of the epithelium of the proximal convoluted tubule of the kidney (12, 15). Comparing these epithelia from a functional point of view one finds that they are similar to a certain extent. The mode of action of Diamox has not yet been fully elucidated, but it is reasonable to assume that its inhibition of carbonic anhydrase will interfere with the formation of aqueous humour. Tonographic studies (3) have also shown that the inflow of aqueous humour into the eye is inhibited with about 60 "„. Are the changes seen in the ciliary epithelium in fact due to the effect of Diamox and are these changes responsible for the inhibition of the secre- tion? After nephrectomy the diuretic effect of Diamox is absent. The use of a control substance (Diazil), which is physically and chemically similar to Diamox but is lacking any effect on the intraocular tension, other secondary effects can be excluded. Therefore it seems highly problable that the changes seen actually are due to the inhibitory effect of Diamox on the secretion. As far as 1 know, no functional changes in the Golgi apparatus have been observed earlier by means of electron microscopy. It is beyond all doubt that there is a marked alteration in the Golgi apparatus of the ciliary epithelium concerning both the amount of vesicles and the arrangement of the membranes. The interpretation of these changes is somewhat difficult at this stage of the investigation, but they may indicate that the Golgi apparatus really takes part in the secretion according to the hypothesis presented in light microscopic investigations. The fact that in the earlier stages of Diamox inhibition a high amount of small vesicles accumu- lates in the cytoplasm of the cells can be explained by a sudden blockage of the outflow of aqueous humor from the cell surface to the posterior cham- ber and its accumulation in vesicles. From these arguments it follows that the changes in the cyto- plasm seen after Diamox injection may be secondary to the inhibition of the secretion. References 1. Barany, E., Acta Phys. Scaiul. 13, 55 (1947). 2. — ibicL 13, 81 (1947). 3. Becker, B., Amer. J. Ophlh. 11, 599 (1955). 4. Davson et al., J. Physiol. 108, 203 (1949). 5. Duke-Elder, S. and Davson, H., B. J. Opiuh. 33, 452 (1949). 6. Friedenwald, J., Arch, of Ophth. 210, 761 (1938). 7. — B. J. Ophlh. 28, 503 (1944). L'appareil de Golgi des Protozoaires 143 8. — Amer. J. Ophtli. 32, 9 (1949). 9. — ihkl. 39, 59 (1955). 10. KiNSEY, V. E. and Barany, E., Atm-r. J. Ophth. 32. 189 (1949). 11. Palm, E., Acta Ophih. 24, 189 (1946). 12. 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Des 1925, Duboscq et Grasse ont affirme que l'appareil parabasal des Flagelles (organite decouvert par Janicki en 1911) est I'homologue de I'idiozome des elements germinaux males des Metazoaires. Dans diverses publications, cette interpretation fut soumise au controle des faits (2, 3, 4). C'est au dictyosome, constituant normal de l'appareil de Golgi que Duboscq et Grasse ont finalement assimile l'appareil parabasal des Flagelles (Zooflagelles, Choanoflagelles, Euglenes, Cryptomonadines, etc.) et les corps osmioreducteurs de certains Rhizopodes (Enta/noeha) et Sporozoaires (Gregarines et Cocci- dies). Dans une note recente (5), j'ai eu I'occasion de montrer par la microscopic electronique la quasi- identite structurale de l'appareil de CJolgi des Zoo- flagelles et des Metazoaires. L'objet de la prcscnte communication est de preciser cette identite et d'en montrer la Constance. Quelle que soit I'especc de Zooflagelles a laquelle on s'adresse, les resultats sont les mcmes : l'appareil parabasal qu'il soit simple (Trimitiis, Foainci) ou complexe (Joenia) ou multiple (Trichonynip/ia, Spirotrichonyinpha) a la meme structure fondamen- tale. II se compose d'un nombre, variable scion les especes, de saccules tres aplatis, empiles les uns sur les autres (14 chez Trimitus, une trentaine chez Joenia annectens). Les saccules ont une parol forte- ment osmiophile et un contenu qui Test tres peu. Leurs bords sont generalement gonfles. Tout autour de la pile de saccules s'ohserve un essaim de vesicu- les de taille reguliere (100 m// env.) a parol osmio- Fig. 1. Foaina grassii, parabasal dont certains saccules ont les bords fortement gonfles. Grandissemenl direct 20.000; photographique 42.000. Fig. 2. Dictyosome dun o\oc\le d' Helix ponialia monlrant Tanalogie de structure avec Ic parabasal de Foaina. Grandis- semenl direct 17.300; photographique 37.000. 144 p. p. GRASSE Fig. 3. « Parabasalie » de Joenia annectens; Remarquer la coupe transversale (noire et compacte) du filament parabasal F. Grandissement direct 20.000; photographique 54.000. phile (moins que celle des saccules) et a contenu grisatre, ce sont les vesicides osniiop/iiles (fig. 1-2). Dans les especes oii un filament particulier (fila- ment parabasal lequel est engendre par le centrosome) relie I'organite au centrosome, les saccules s'orientent par rapport a celui-ci de telle sorte que le filament s'appuie sur le saccule superieur de la pile, lequel saccule est plus ou moins creuse en une gouttiere qui regoit le filament (fig. 4). Aucune autre liaison n'a ete observee entre les saccules et le filament. De toute evidence, les saccules forment la subs- tance chromophile de Tappareil parabasal; nous ne pensons pas que les vesicules osmiophiles etant donne leur petitesse soient visibles en microscopic optique, sauf lorsqu'elles sont extremement abon- dantes, ce qui arrive. Quant a la substance chromophobe, si nette chez les Protozoaires, il n'est pas possible de la reconnaitre dans tous les cas; nous croyons pouvoir affirmer qu'elle n'est pas un constituant constant et fonda- mental de I'appareil de Golgi. L'examen d'un nombre eleve de preparations conduit a Tinterpretation que voici : Les saccules osmiophiles les plus distaux, c'est a dire ceux qui, conventionnellement sont le plus eloignes du filament parabasal, se gonflent, tan- dis que leurs contours perdent toute nettete; ils deviennent une grande vesicule claire (fig. 3), laquelle nous parait exactement correspondre au lisere ou a la gouttelette chromophobe montre, sous le micro- scope optique, par le dictyosome, apres son impre- gnation osmique. Cette « secretion » ne nous a pas paru etre constante, ce qui explique Tabsence de substance chromophobe dans certains dictyosomes vus au microscope optique. Dans quelques preparations, concernant surtout des Foaina, on observe des vesicules non distales, mais a position intercalaire, dont la region marginale est extremement gonflee en bulle claire qui. liberee se confond, peut-etre, avec de la substance chromo- phobe (fig. 1). Fig. 4. Dictyosome ou parabasal de Tric/ionympha agilis (symbiote de Reticiilitemies liicifiigiis), montrant la produc- tion par perlage lateral, des vesicules osmiophiles, et de la substance chromophobe par « vesiculisation » totale des saccules distaux. Grandissement direct 20.000; photographi- que 43.000. Microscope electronique RCA EMU 3A. L'identite de structure de I'appareil parabasal et des dictyosomes de Metazoaires, parait totale : memes lamelles osmiophiles plates et empilees les unes sur les autres, meme mode de production de vesicules osmiophiles. Les difl"erences tiennent 1° au rapport de conti- guite de certains parabasaux avec un derive centro- somien, le filament parabasal, mais les dictyosomes eux-memes, sont tres souvent attires par le centro- some; 2° a la production de substance chromophobe, surtout par la vesiculisation totale des saccules dis- taux, laquelle n'a pu etre vue en toute certitude dans les dictyosomes'. La ressemblance va si loin que, dans un lot de photographies ou parabasaux et dictyosomes sont melanges, le biologiste non prevenu n'evite pas les confusions. L'appareil de Golgi, qu'il appartienne a un Proto- zoaire ou a un Metazoaire, presente les memes caracteristiques, a savoir : 1° une pile de saccules osmiophiles. 2° un nuage de vesicules osmiophiles, incontes- tablement issues des saccules. La substance chromophobe de tous derive pro- bablement de la vesiculisation totale de certains saccules, mais nous n'en avons la preuve que pour les Protozoaires. Au total, l'appareil de Golgi — aussi bien chez les Metazoaires que chez les Protozoaires — est un con- stituant cytoplasmique caracterise par sa structure et par son activite secretoire (vesicules osmiophiles, 1 Sur un appareil de Golgi aussi puissamment secreteur que celui des glandes multifides de VHelix pomatia, il ne nous a pas ete possible de suivre la transformation des saccules en produi